劉玲 陳祥平 范小敏

摘要：為了建立經(jīng)濟穩(wěn)定的桑樹簡單重復(fù)序列（SSR）-PCR反應(yīng)體系，為SSR分子標(biāo)記在桑樹研究中更廣泛地應(yīng)用提供試驗基礎(chǔ)，采用L16（45）正交試驗設(shè)計和單因素試驗，對桑樹SSR-PCR反應(yīng)體系中的模板DNA濃度、引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度和rTaq酶用量5個因素的4個水平進行優(yōu)化分析，并比較這5個因素的不同濃度對擴增效果的影響。結(jié)果表明，各因素水平變化對反應(yīng)體系的影響大小依次為Mg2+、dNTPs>引物>模板DNA>rTaq酶。研究最終確立了最佳反應(yīng)體系，即在10 μL反應(yīng)體系中，含有1.5 μL 10～20 ng/μL DNA模板、0.4 μL 25 mmol/L Mg2+、0.5 μL 2 mmol/L dNTPs、各0.15 μL 20 μmol/L正反向引物、0.1 μL 5 U/μL rTaq酶和1 μL 10×loading buffer。通過穩(wěn)定性檢測，表明該體系能夠用于桑樹的SSR分析。

關(guān)鍵詞：桑樹;正交試驗設(shè)計;單因素試驗;SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

中圖分類號： S888.2 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0045-05

桑樹是?？疲∕oraceae）桑屬（Morus L.）的多年生木本植物，是重要的經(jīng)濟植物，桑葉是家蠶的主要飼料。我國地域遼闊，生態(tài)環(huán)境各異，經(jīng)過長期的自然選擇和人工選育，形成了非常豐富的桑樹種質(zhì)資源。因此，研究桑樹的遺傳多樣性及其親緣關(guān)系對桑樹的栽培育種、良種選育等有重要意義。

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，簡稱SSR）DNA，又稱微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA），是由Moore和Terer等于1991年提出的，它是以1～6 bp核苷酸為重復(fù)單位而多次串聯(lián)重復(fù)組成的DNA序列。SSR具有多態(tài)性高、試驗操作簡單、共顯性等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于植物的分子連鎖圖譜構(gòu)建、基因定位、品種遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析、純度鑒定、雜種優(yōu)勢的預(yù)測等[1]。

SSR是一種基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記，試驗結(jié)果易受反應(yīng)組分的影響，為了確保試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，建立和優(yōu)化SSR-PCR反應(yīng)體系是非常必要的。目前，應(yīng)用SSR分子標(biāo)記研究桑樹種質(zhì)資源遺傳多樣性等方面的報道較少，關(guān)于桑樹SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的研究僅見羅義維等報道的采用正交設(shè)計試驗的優(yōu)化過程[2]。本研究參考已有的桑樹SSR研究[2-7]，采用正交試驗和單因素優(yōu)化試驗結(jié)合的方法，對桑樹SSR-PCR反應(yīng)體系中的模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶5個因素的4個水平進行優(yōu)化分析，以期建立經(jīng)濟、實用、穩(wěn)定的反應(yīng)體系，為SSR分子標(biāo)記在桑樹研究中更廣泛地應(yīng)用提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗材料采自四川省絲綢科學(xué)研究院桑樹種質(zhì)資源圃，詳見表1。選擇桑樹品種豐臺作為體系優(yōu)化用的DNA模板。引物序列參照Aggarwal等的研究[8-10]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，詳見表2。PCR反應(yīng)所用的Mg2+、dNTPs、rTaq酶、DNA marker和10×loading buffer均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 桑樹總DNA提取及質(zhì)量檢測 桑葉總DNA采用2種方法從用0.15 g硅膠干燥的桑葉中提取，一種是稍加改進的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[11]，另一種是在用4×CTAB提取前，先用去糖緩沖液抽提。取3 μL提取的DNA樣品，在1%瓊脂糖凝膠中電泳20 min，電泳完畢后在WFH-201B紫外反射透射儀中觀察DNA條帶。利用KAIAO K5500微量紫外分光光度計檢測DNA濃度，之后于-20 ℃保存。

1.2.2 PCR擴增及產(chǎn)物的電泳檢測 PCR反應(yīng)在Thermal Cycler（上海山富科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）上進行。PCR反應(yīng)體系總體積為10 μL，包括Mg2+、dNTPs、rTaq聚合酶、正反向引物、模板DNA和10×loading buffer。PCR反應(yīng)程序參照趙衛(wèi)國的報道[12]，采用降落PCR：95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，63 ℃退火1 min，每個循環(huán)降低0.5 ℃，72 ℃延伸 1 min，16個循環(huán);94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，24個循環(huán);72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后控制溫度在 10 ℃。

將擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上檢測。進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時，在DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀上，于200～220 V預(yù)電泳10～20 min。預(yù)電泳完畢，垂直平穩(wěn)地拔出凝膠中的梳子，上樣10 μL（3 μL ddH2O，3 μL 6×loading buffer，4 μL PCR產(chǎn)物），上樣完畢后，在 120 V 電壓下電泳，待溴酚藍指示劑跑到下層瓊脂糖封口處時停止電泳，用時大約為1 h 40 min。采用銀染法（1.0 g/L AgNO3）染色，并在顯色液（在200 mL蒸餾水中加4 g NaOH、0.08 g Na2CO3和0.8 mL甲醛）中顯色3～5 min至電泳條帶清晰可見，用數(shù)碼相機拍照并保存圖片。

1.2.3 SSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 對于PCR反應(yīng)體系中的5個因素（模板DNA濃度、引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度和rTaq酶用量），每個因素分別設(shè)置4個水平，詳見表3。

1.2.3.1 正交試驗 采用L16（45）正交設(shè)計，共16個反應(yīng)體系（表4）。除表4中的變化因素外，每管還含有1 μL 10×buffer，引物為Mulstr-l，每個反應(yīng)體系設(shè)2次重復(fù)。

1.2.3.2 單因素試驗 根據(jù)正交試驗確定的最佳反應(yīng)體系，依次優(yōu)化Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、rTaq酶用量和模板DNA濃度5個單因素，每個水平設(shè)2次重復(fù)。當(dāng)其中1個因素水平變化時，體系中其他成分的水平保持不變。

1.2.4 退火溫度的優(yōu)化 以確定的最佳反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，以提取的豐臺DNA作為模板，對引物Mulstr-l的退火溫度進行優(yōu)化篩選，設(shè)定退火溫度范圍為（55±63） ℃，根據(jù)PCR儀自動生成的12個溫度梯度進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。

1.2.5 最佳反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測及應(yīng)用 選擇2個桑樹材料嘉陵16號、樂山花桑，選擇2對引物，對優(yōu)化出的反應(yīng)體系進行穩(wěn)定性檢測，每個樣品、每對引物設(shè)4個重復(fù)。選擇4對引物，用優(yōu)化得到的反應(yīng)體系，以7份桑樹DNA為模板進行SSR擴增。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹基因組DNA的提取結(jié)果

如圖1所示，采用4×CTAB法提取桑樹總DNA的結(jié)果顯示，點樣孔明亮，說明有糖類等雜質(zhì)，并且部分材料拖尾比較嚴(yán)重;而在加入提取液之前加入去糖緩沖液得到的DNA，點樣孔沒有雜質(zhì)污染，只有輕微拖尾，說明去糖緩沖液能夠有效去除桑葉中的多糖等雜質(zhì)，提取得到的DNA更純，能夠滿足SSR試驗要求。

2.2 SSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系的直觀分析

由SSR-PCR正交試驗結(jié)果（圖2）可以看出，16個反應(yīng)體系的擴增結(jié)果差異明顯。第1、6、14、15組合存在非特異性擴增條帶，且目的條帶擴增不完全;第2、9、11、16組合的擴增結(jié)果不穩(wěn)定，2次重復(fù)擴增出的條帶不一致，且有非特異性擴增條帶;第5組合條帶清晰，但是目的條帶擴增不完全;第4、7、8、10、12、13組合的目的條帶擴增完全，但是第8、12組合的背景較深，第10、13組合2個重復(fù)中1個重復(fù)的目的條帶較淺;第4、7組合的目的條帶擴增完全、清晰、重復(fù)性好。綜合每組的2個重復(fù)，以及從經(jīng)濟節(jié)約的角度考慮，選擇第7組合為最優(yōu)體系，即10 μL反應(yīng)體系中，含有1.5 μL 10～20 ng/μL DNA模板，各0.20 μL 20 μmol/L正反向引物，1.0 μL 25 mmol/L Mg2+，0.5 μL 2 mmol/L dNTPs，0.20 μL 5 U/μL rTaq酶和1 μL 10×loading buffer，用ddH2O補至10 μL。

為了進一步證明對試驗結(jié)果初步判斷的準(zhǔn)確性，根據(jù)李志勇等的方法[13]對正交設(shè)計試驗中的各組分濃度組合進行分析，結(jié)果見表5，其中k值代表某因子在某水平下參與反應(yīng)所產(chǎn)生的擴增條帶數(shù)的平均值。在本研究中，5個因素在設(shè)定的4個水平下對結(jié)果的影響由大到小依次為Mg2+、dNTPs濃度>引物濃度>模板DNA濃度>rTaq酶用量。

k值反映了影響因素各水平對反應(yīng)體系的影響情況，k值越大，反應(yīng)水平越好。模板DNA濃度以1水平最好，引物濃度以4水平最好，Mg2+濃度以3水平最好，dNTPs濃度以1、2水平最好，rTaq酶用量以3、4水平最好。因此可見，桑樹 SSR-PCR的最佳反應(yīng)體系為1 ng/μL模板DNA+0.5 μmol/L 引物+ 2 mmol/L Mg2++0.10 或 0.15 mmol/LdNTPs+0.15或0.2 U/μL rTaq酶。綜合分析第4、7、8、12組合試驗設(shè)計中每個因素的水平和實際擴增效果，認為第8組合每個因素的水平與理論值最接近，因此，分別以第7、8組反應(yīng)體系為基礎(chǔ)進行單因素優(yōu)化試驗。

2.3 單因素優(yōu)化的結(jié)果分析

以第8組合為基礎(chǔ)進行單因素優(yōu)化試驗，結(jié)果顯示，電泳圖背景深，主帶不明顯，無法讀帶（圖略）。說明理論得出的最佳體系的效果需要進一步檢驗優(yōu)化，同時也反映理論與實際存在一定的差距。

以第7組合為基礎(chǔ)，進行單因素優(yōu)化。如圖3所示，當(dāng)模板DNA濃度為2.5 ng/μL時，目的條帶擴增不完全;當(dāng)模板DNA濃度為1.0、2.0 ng/μL時，2個重復(fù)的擴增結(jié)果不穩(wěn)定。綜合4種濃度的電泳結(jié)果，選擇1.5 ng/μL作為模板DNA的最佳濃度。當(dāng)引物濃度為0.2、0.4 μmol/L時，擴增結(jié)果不穩(wěn)定;當(dāng)引物濃度為0.5 μmol/L時，電泳背景較深;當(dāng)引物濃度為0.3 μmol/L時，有清晰的目的條帶。因此，確定引物的最佳濃度為0.3 μmol/L。當(dāng)Mg2+濃度大于1.5 mmol/L時，擴增不穩(wěn)定;當(dāng)Mg2+濃度為1.0、1.5 mmol/L時，都能擴增出明顯的條帶;但當(dāng)Mg2+濃度為1.5 mmol/L時的背景較深，所以選擇1.0 mmol/L為Mg2+的最佳濃度。當(dāng)dNTPs濃度為0.15、0.20 mmol/L時，條帶擴增不穩(wěn)定;當(dāng)dNTPs濃度為0.10、0.25 mmol/L時，都有清晰的目的條帶。從經(jīng)濟節(jié)約角度考慮，選擇0.1 mmol/L為dNTPs的最佳濃度。當(dāng)rTaq酶用量為0.15、0.2 U/μL時，存在非特異性擴增;當(dāng)rTaq酶用量為0.05 U/μL時，目的條帶清晰且重復(fù)性好，因此確定rTaq酶的最佳用量為0.05 U/μL。

以上結(jié)果表明，正交設(shè)計能夠考慮各因素間的交互作用，單因素試驗可以對反應(yīng)體系中每個因素的不同水平進行直觀分析[14]。與正交試驗相比，在單因素試驗中，除了模板DNA濃度、dNTPs濃度相同外，引物濃度、Mg2+濃度和酶用量都有所降低。綜合2種試驗結(jié)果，確定在10 μL桑樹SSR-PCR反應(yīng)體系中，5個因素分別為1.5 ng/μL模板DNA，各 0.3 μmol/L 正、反向引物，1.0 mmol/L Mg2+，0.1 mmol/L dNTPs，0.05 U/μL rTaq酶。

2.4 最適退火溫度的確定

如圖4所示，在不同退火溫度下，擴增效果存在差異。退火溫度為55.0、56.6、57.5 ℃時，都能擴增出目的條帶;退火溫度為55.8 ℃時，2個重復(fù)出現(xiàn)擴增不穩(wěn)定的情況;退火溫度高于58.5 ℃時，擴增的條帶數(shù)減少，PCR產(chǎn)物量較低。從主帶清晰度及背景深淺來考慮，引物Mulstr-l的退火溫度選擇56.6 ℃為宜。因此，引物Mulstr-1優(yōu)化后的PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s，56.6 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸60 s，37個循環(huán);72 ℃延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束后保存在10 ℃。

2.5 最佳反應(yīng)體系的穩(wěn)定性檢驗及其應(yīng)用

用2個桑樹材料嘉陵16號、樂山花桑，選擇MulSTR5、Mulstr-l這2對引物，對優(yōu)化出的反應(yīng)體系進行穩(wěn)定性檢驗，每個樣品、每對引物設(shè)4次重復(fù)。由圖5可以看出，2個樣品的4次重復(fù)都能夠穩(wěn)定地擴增出明顯的條帶，說明該優(yōu)化體系穩(wěn)定可靠。

采用MulSTR5、MulSTR4、Mul3SSR197和Mul3SSR183這4對引物，利用優(yōu)化后的SSR-PCR反應(yīng)體系，對7份桑樹種質(zhì)進行擴增。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，這4對引物都獲得了清晰的條帶（圖6），表明該反應(yīng)體系的特異性、可重復(fù)操作性和穩(wěn)定性較好。

3 討論與結(jié)論

桑樹是我國重要的經(jīng)濟作物，優(yōu)化并建立適合桑樹的SSR-PCR反應(yīng)體系，是SSR標(biāo)記在桑樹中應(yīng)用的重要基礎(chǔ)。目前對SSR-PCR體系優(yōu)化的方法有單因素設(shè)計和正交設(shè)計等。正交設(shè)計能夠分析因素間的交互作用，但是由于其試驗體系較小，受到的試驗操作誤差較大，而且也不能顧及個別因素的影響，而單因素試驗正好能夠彌補正交試驗的不足[15]。本研究通過綜合考慮正交試驗和單因素優(yōu)化試驗的方法，對PCR反應(yīng)中的5個因素進行優(yōu)化，得到桑樹SSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系，即10 μL反應(yīng)體系中，含有1.5 μL 10～20 ng/μL模板DNA，0.4 μL 25 mmol/L Mg2+，0.5 μL 2 mmol/L dNTPs，各0.15 μL 20 μmol/L正反向引物，0.1 μL 5 U/μL rTaq酶和1 μL 10×loading buffer。通過穩(wěn)定性檢驗，證明該反應(yīng)體系穩(wěn)定、可靠，為今后SSR在桑樹領(lǐng)域更廣泛的應(yīng)用提供了相應(yīng)支持。

PCR反應(yīng)體系中各組分的濃度會對擴增效果產(chǎn)生影響。Mg2+濃度過低時，會降低DNA聚合酶的活性;Mg2+濃度過高時，會降低擴增的特異性。dNTPs濃度過低時，產(chǎn)物條帶模糊不清;dNTPs濃度過高時時，會出現(xiàn)非特異性擴增。引物用量過少時，產(chǎn)物量過低;用量過多時，會產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物和引物二聚體。DNA聚合酶的用量直接決定PCR反應(yīng)的結(jié)果，用量過高時，容易產(chǎn)生非特異性擴增產(chǎn)物;用量過低時，則會導(dǎo)致目的條帶合成量減少。模板DNA濃度也會影響擴增效果，在彭波等的研究中，模板濃度達到了2.5 ng/μL[3-4]，而本試驗結(jié)果表明，模板DNA的量并非越大，擴增效果越好，在設(shè)定的4個濃度中，前2個濃度1.0、1.5 ng/μL的擴增效果較后2個濃度的好。羅義維等的研究表明，模板DNA的濃度與本研究結(jié)果相當(dāng)，可見適當(dāng)降低模板的濃度能得到相對清晰的條帶[2，6]。在本研究得到的最佳反應(yīng)體系中，每個因素的濃度與羅義維等的研究結(jié)果[2]相比，除了模板DNA的濃度差異不大外，其余4個因素的濃度均低于后者，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是研究方法、目的、試驗材料、引物、技術(shù)要求不同造成的。

除了以上5種因素會影響PCR擴增效果外，引物退火溫度也是1個關(guān)鍵因素。退火溫度過高時，模板與引物退火反應(yīng)緩慢而不準(zhǔn)確;退火溫度過低時，則會產(chǎn)生引物二聚體和雜帶[16]。不同引物的退火溫度需要摸索才能確定，本研究只優(yōu)化篩選了引物Mulstr-l的退火溫度，為56.6 ℃。當(dāng)采用多個引物同時擴增時，反應(yīng)程序可采用降落PCR方法。降落PCR能夠避免或有效降低由反應(yīng)體系內(nèi)主要組分濃度過高或過低、引物序列較短、退火溫度過高或過低、模板DNA復(fù)雜等因素引起的非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生[17]，并且省去了摸索引物退火溫度的繁瑣步驟，從而大大縮短了試驗時間。

綜上所述，在SSR-PCR擴增中，應(yīng)綜合考慮各反應(yīng)組分的濃度和引物退火溫度，才能得到有效的擴增條帶，從而增強結(jié)果的真實性。

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