劉昆昂 劉萌 張根偉

摘要：金針菇是雙因子控制的四極性異宗結(jié)合的食用菌，與其他異宗配合的食用菌一樣，主要采用選擇育種、雜交育種、誘變育種、原生質(zhì)體融合和基因工程育種等育種方法進(jìn)行育種，其中選擇育種是其他一切育種方法的基礎(chǔ)。雜交育種手段繁瑣費(fèi)事，但目的性和方向性都比較明確，仍然是目前培育金針菇新的優(yōu)良菌株的真正有效方法。誘變育種多采用金針菇的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，但誘變育種只擴(kuò)大了變異范圍，并不能定向誘變，后期篩選工作將會(huì)十分繁瑣，誘變率也偏低。原生質(zhì)體融合方法具有重組頻率高、受結(jié)合型限制較小、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整、重組體種類(lèi)多、有助于外源基因轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)。隨著各種測(cè)序技術(shù)和分析手段的不斷發(fā)展，金針菇的基因工程育種將成為未來(lái)菌株改良的新途徑。

關(guān)鍵詞：金針菇;選擇育種;雜交育種;誘變育種;原生質(zhì)體融合;基因工程育種

中圖分類(lèi)號(hào)：S646.1+50.32 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）14-0018-05

金針菇[Flammulina velutipes （Curt. Ex Fr.） Sing.]，別稱(chēng)構(gòu)菌、冬菇、毛柄金錢(qián)菌，屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）金錢(qián)菌屬（Flammulina）[1]。金針菇營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美且兼具藥用價(jià)值，富含蛋白質(zhì)、多糖、維生素和氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中人體所必需的8種氨基酸占氨基酸總量的44.5%，其中賴(lài)氨酸和亮氨酸等人體必需氨基酸的含量高于其他菇類(lèi)，因此又稱(chēng)增智菇。金針菇作為一種優(yōu)質(zhì)的膳食纖維來(lái)源，還具有促進(jìn)消化、排除重金屬離子和降低膽固醇的作用，其中含有的多糖成分，還可預(yù)防高血壓和腫瘤等疾病，經(jīng)常食用可明顯提高人體免疫力。

金針菇在世界各地分布廣泛，主要集中在中國(guó)、日本和韓國(guó)等地，在國(guó)際食用菌市場(chǎng)上，金針菇的產(chǎn)銷(xiāo)量位居第4。20世紀(jì)60年代，日本開(kāi)始通過(guò)空調(diào)設(shè)備與各種自動(dòng)化裝置，實(shí)現(xiàn)了金針菇的工廠化栽培，整個(gè)金針菇栽培管理過(guò)程全部自動(dòng)化。金針菇菌種作為發(fā)展金針菇的基礎(chǔ)生產(chǎn)資料，對(duì)金針菇生產(chǎn)起著關(guān)鍵性作用，直接影響其產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，金針菇生產(chǎn)與研究的關(guān)鍵是對(duì)具有高產(chǎn)、抗病、廣溫等優(yōu)良農(nóng)藝性狀菌株的篩選。

1 金針菇生活史

金針菇是雙因子控制的四極性異宗結(jié)合的食用菌，有性世代產(chǎn)生擔(dān)孢子，每個(gè)擔(dān)孢子產(chǎn)生4個(gè)擔(dān)孢子，交配型可以分為4種，分別為AB、ab、Ab、aB[2]。金針菇單個(gè)擔(dān)孢子發(fā)育而來(lái)的同核體菌絲為單核，無(wú)鎖狀聯(lián)合，單核菌絲也可以形成子實(shí)體，但與雙核相比子實(shí)體小且發(fā)育不良。具有可親和交配型的單孢菌絲經(jīng)過(guò)質(zhì)配形成異核體菌絲，異核體菌絲雙核，具有鎖狀聯(lián)合，雙核菌絲經(jīng)過(guò)發(fā)育后扭結(jié)形成原基，進(jìn)而發(fā)育形成異核子實(shí)體，異核子實(shí)體的原擔(dān)子細(xì)胞為異核體，胞內(nèi)具有2個(gè)核，這2個(gè)核經(jīng)過(guò)核配融合為1個(gè)二倍核，二倍核的擔(dān)子進(jìn)行減數(shù)分裂形成4個(gè)單倍子核，4個(gè)子核分別進(jìn)入4個(gè)擔(dān)孢子中，隨著擔(dān)孢子繼續(xù)發(fā)育，其中的單核再進(jìn)行1次有絲分裂，成熟擔(dān)孢子為雙核，但這2個(gè)核是同質(zhì)的。金針菇的無(wú)性階段，單核菌絲和雙核菌絲都可以產(chǎn)生單核的粉孢子，粉孢子在條件適宜時(shí)可以萌發(fā)出單核菌絲或者雙核菌絲[3]。

2 育種方法

2.1 選擇育種

選擇育種（selective breeding）是以食用菌的自然變異為基礎(chǔ)，有意識(shí)地控制和積累有益的突變，經(jīng)過(guò)不斷的優(yōu)勝劣汰，培育出新的優(yōu)良品種的育種方法，該方法操作簡(jiǎn)單， 應(yīng)用廣泛，是最傳統(tǒng)的方法，也是各種育種方法的基礎(chǔ)[2]。目前用于人工栽培的食用菌菌種絕大多數(shù)都是由野生菌種馴化而來(lái)，馴化育種又稱(chēng)為人工選擇，以品種在自然界中的變異為基礎(chǔ)，選育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株，我國(guó)引進(jìn)和馴化栽培成功的食用菌已達(dá)80多個(gè)種[4]。野生育成的菌株具有菌柄粗、色澤深、菌蓋大、絨毛多、抗病性強(qiáng)、生物轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)，并且子實(shí)體脆嫩，與野生菇一樣鮮美。我國(guó)金針菇種質(zhì)資源比較豐富，地方品種繁多[5]，須要充分了解當(dāng)?shù)厥秤镁姝h(huán)境、生活習(xí)性以及遺傳特性等特征，利用孢子分離法或組織分離法進(jìn)行分離，將篩選出的野生菌株不斷進(jìn)行人工選擇，改變部分特性，逐漸培養(yǎng)為栽培種[6]。野生食用菌馴化栽培是食用菌育種的重要內(nèi)容。劉勝貴等對(duì)湖南省懷化市郊區(qū)采集的野生金針菇F9703菌株進(jìn)行馴化，并與雜交19菌株在菌絲生活力、出菇特征、生物學(xué)效率等方面進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金針菇F9703菌株的菌絲生活力、生物學(xué)效率均強(qiáng)于雜交19菌株，但子實(shí)體外觀品質(zhì)略差[7]。周建林等對(duì)浙江省江山市主栽金針菇品種江山白菇進(jìn)行組織分離，經(jīng)逐年自然篩選，選育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)的白色金針菇新品種F21-2，該品種已成為浙江省金針菇栽培的重要品種[8]。馴化成功后，人們又采用雜交育種、誘變育種、原生質(zhì)體融合等多種方式進(jìn)一步對(duì)該菌種進(jìn)行改造，最終形成多個(gè)生產(chǎn)上常用的新菌株。

2.2 雜交育種

雜交育種（crossbreeding）也是食用菌常用的育種方法，著眼于雙親性狀的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)或借助于一親本的優(yōu)點(diǎn)去克服另一親本的缺點(diǎn)，其目的性及方向性都比較明確[9]。選擇適當(dāng)?shù)挠H本是雜交育種成功的關(guān)鍵，首先選擇的2個(gè)親本都應(yīng)該具有突出的優(yōu)點(diǎn)，其次親本之間應(yīng)具有較大的遺傳差異，再次親本之間應(yīng)具有較好的配合力。雜交育種一般費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且對(duì)各項(xiàng)操作步驟要求都較高，但卻是目前食用菌育種最常用的方法，尤其在異宗結(jié)合的食用菌新品種選育中使用最廣泛，收效最顯著[6]。金針菇是異宗結(jié)合的食用菌，可以利用不同性別的單核菌絲進(jìn)行雜交，其雜交方法有單孢雜交和多孢雜交，目前雜交育種是對(duì)金針菇品種改良和選育最有效的方法[10]。食用菌雜交育種主要分為單單雜交、雙單雜交和多孢雜交，單單雜交配對(duì)后的雜交菌株必須通過(guò)出菇試驗(yàn)確定優(yōu)劣。自然界中單單雜交的機(jī)會(huì)極少，多數(shù)是多孢雜交獲得的優(yōu)勢(shì)菌株，這些菌株具有菇形圓整、抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。

金針菇雜交19號(hào)菌株，是以日本信濃二號(hào)和三明一號(hào)為親本進(jìn)行多孢子雜交選育出來(lái)的一個(gè)優(yōu)良雜交菌株，于1988年年底通過(guò)鑒定[13]。F-7是以雜交19為親本，通過(guò)多孢雜交選育而成的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)菌株，其色澤黃白，外形美觀，菌柄基部無(wú)褐色，菌柄細(xì)而挺直，菌蓋小，耐高溫能力強(qiáng)[14]。王波等對(duì)從Fv12中分離出的單孢菌株進(jìn)行兩兩相互配對(duì)雜交，共配對(duì)雜交組合228個(gè)，以鎖狀聯(lián)合為標(biāo)記鑒別雜交種，確定雜交菌株有72個(gè)，雜交率為31.6%，經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，得到1株較優(yōu)良的菌株川金2號(hào)[15]。王波等通過(guò)黃色金針菇與白色金針菇雙單雜交選育出了金針菇新品種川金3號(hào)，該品種于2006年通過(guò)四川省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定[16]。徐珍等以金針菇菌株F3-31和FM-83為親本，利用單孢子分離技術(shù)，經(jīng)過(guò)單單雜交選育出菇形好、生育期短、產(chǎn)量高的白色優(yōu)良菌株G1，彌補(bǔ)了F3-31顏色淺黃、菌蓋傘形、產(chǎn)量較低和FM-83生育期長(zhǎng)、抗性差的不足[17-18]。金針菇農(nóng)金6號(hào)是以黃色品種三明一號(hào)與白色品種金21、金3為親本通過(guò)雜交選育獲得的1株菇形好、生育期短、產(chǎn)量高、適應(yīng)性廣的白色金針菇菌株，于2012年4月通過(guò)福建省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)認(rèn)定[19]。王波等以黃色金針菇與白色金針菇為親本，通過(guò)雙單雜交獲得雜交種后再自交得到早熟白色金針菇F2121，再分別與白色金針菇F21和金白F4的雙核體進(jìn)行雙單雜交，獲得優(yōu)良白色金針菇川7金號(hào)和川金8號(hào)[20]。金針菇川金33是以早熟白色金針菇菌株F363和晚熟白色金針菇菌株FNK1302為親本，通過(guò)雙單雜交選育出來(lái)的，其子實(shí)體白色，菌蓋大、不易開(kāi)傘，菌柄粗壯、基部不粘連，該品種于2016年通過(guò)四川省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定并大面積示范應(yīng)用[21]。

雜交育種的一般程序：（1）選擇具有優(yōu)良目的性狀的親本且孢子成熟的子實(shí)體，收集孢子;（2）采用玻片稀釋法、平板稀釋法和顯微操作器分離法進(jìn)行單孢分離;（3）單單雜交，先對(duì)單孢子進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基上接入2個(gè)雜交親本的單核菌絲各1塊，2單孢菌絲接觸后，鏡檢接觸處的菌絲體，挑取雙核菌絲;雙單雜交，即雙核親本與另一個(gè)單核菌絲親和，配對(duì)成功;多孢雜交，是直接將稀釋后孢子涂平板，挑取生長(zhǎng)速度快的菌絲進(jìn)行雙核鑒定;（4）得到一定數(shù)量的雜交菌株后，要選擇適當(dāng)?shù)脑耘喾绞綄?duì)優(yōu)良菌株進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，包括生產(chǎn)性狀、抗逆性等;（5）將初步篩選出的雜交菌株通過(guò)進(jìn)一步的生產(chǎn)試驗(yàn)（包括區(qū)域性試驗(yàn)）來(lái)進(jìn)行復(fù)篩，從而更加確定雜交菌株的各種性狀，預(yù)估出雜交菌株的生產(chǎn)價(jià)值和推廣價(jià)值，對(duì)于各項(xiàng)性狀都理想的菌株要保留，并及時(shí)進(jìn)行推廣，獲得優(yōu)良菌株[22]。

2.3 誘變育種

誘變育種（mutation breeding）是人為利用某些物理或化學(xué)因子處理細(xì)胞群體，促使其中少數(shù)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起其遺傳性變異，再?gòu)亩喾N突變體中選出正突變菌株的方法，誘變育種也是獲得優(yōu)良食用菌菌株的常用手段之一[2]。遺傳育種上常用的突變株有營(yíng)養(yǎng)缺陷突變株，如氨基酸、維生素、堿基等合成能力有缺陷的突變株;另外還有溫度敏感突變株，指可在某一溫度條件下生長(zhǎng)而在另一溫度條件下不生長(zhǎng)的突變株;還有一種是對(duì)某種藥物具有一定抵抗力的突變株，通過(guò)誘變劑處理孢子可以提高產(chǎn)生抗性突變的幾率。

誘變育種技術(shù)主要包括物理誘變和化學(xué)誘變，當(dāng)前金針菇常用的物理誘變主要包括紫外線（UV）、60Co-γ射線、激光、微波、常壓室溫等離子體（ARTP）及航空等誘變。F8815和F8817是以三明一號(hào)為出發(fā)菌株，選用菌絲原生質(zhì)體為誘變材料，經(jīng)γ射線輻射誘變，從雙核再生株中選育出來(lái)的，這是食用菌中首例采用原生質(zhì)體誘變方法選育出來(lái)的子實(shí)體色澤淺、產(chǎn)量高并表現(xiàn)出廣溫出菇的新品種，于1992年12月通過(guò)部級(jí)成果鑒定[23-24]。成亞利等用紫外線照射金針菇Y(jié)19和W088菌株原生質(zhì)體1 min，再生后挑選生長(zhǎng)好的菌株，與出發(fā)菌株相比，變異菌株生長(zhǎng)速度提高23.1%～52.3%，出菇時(shí)間提早10～14 d[25]。李耀維等用He-Ne激光輻照誘變金針菇三明1號(hào)的原生質(zhì)體、菌絲體片段和分生孢子懸液，通過(guò)初篩、復(fù)篩及突變株遺傳穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，采用原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，其正突變率、單株超氧化物歧化酶（SOD）產(chǎn)量提高率、產(chǎn)SOD遺傳穩(wěn)定性均高于菌絲體與分生孢子[26]。周丹對(duì)金針菇F40原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變處理，經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，選出硒含量和生物量明顯高于出發(fā)菌株的突變株Y12和Y57[27]。解生權(quán)等通過(guò)對(duì)市售金針菇馴化后的菌株進(jìn)行紫外誘變處理60 min，獲得了比原菌絲體生長(zhǎng)能力旺盛的菌種，誘變菌種的斜面培養(yǎng)時(shí)間為7～10 d[28]。陳力力等比較了紫外線和微波單因子對(duì)金針菇J05Y-c單細(xì)胞懸液的誘變效應(yīng)，通過(guò)比較誘變致死率、正變率、透明圈直徑與菌落直徑比例（HC值）、菌絲生長(zhǎng)量和傳代穩(wěn)定性進(jìn)行優(yōu)勢(shì)菌株篩選，結(jié)果表明，誘變效應(yīng)的最佳劑量范圍在致死率為75%～90%的處理組，相同處理時(shí)間內(nèi)，微波誘變的正變率大于紫外誘變;采用最大功率為 700 W、脈沖頻率為2 540 MHz的微波爐，以中等功率強(qiáng)度處理80 s，獲得HC值、菌絲生長(zhǎng)量比出發(fā)菌株提高32.38%、62.16% 的優(yōu)勢(shì)突變株W8011，連續(xù)8次傳代遺傳性能穩(wěn)定[29]。張誠(chéng)等將金針菇品種江山白F21菌絲體通過(guò)返回式衛(wèi)星進(jìn)行航天搭載，從7個(gè)變異菌株中篩選獲得金針菇新品種航金1號(hào)，與出發(fā)菌株相比，該品種菇形好、早熟、產(chǎn)量高、耐高溫和適應(yīng)性廣[30]。楊茹等采用常壓室溫等離子體對(duì)菌株AR0進(jìn)行處理，通過(guò)抗病性、纖維含量及親緣關(guān)系測(cè)定，篩選出菌株AR12和AR17，AR12與出發(fā)菌株相比抗托拉斯假單胞桿菌能力提高15.49%，菌絲體纖維含量降低1582%;AR17抗托拉斯假單菌能力提高1.90%，菌絲體纖維含量降低36.31%[31]。

金針菇常用的化學(xué)誘變劑主要有氯化鋰、甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯和亞硝基胍（NTG）、亞硝酸等，目前多采用化學(xué)誘變結(jié)合物理誘變的方式對(duì)金針菇進(jìn)行處理?？盗种サ炔捎米贤庹T變、硫酸二乙酯誘變以及紫外、氯化鋰和硫酸二乙酯復(fù)合誘變這3種方法獲得高溫節(jié)能型金針菇新菌株FLAIUV、FLAIEMs、FLA7EMS、FLAIUV+LICIEMS，其菌絲可在33 ℃高溫下正常生長(zhǎng)、在20 ℃下可以正常發(fā)育形成子實(shí)體[32]。金玲等利用60Co-γ射線誘變金針菇原生質(zhì)體，對(duì)金針菇73#進(jìn)行改良，培養(yǎng)出生物轉(zhuǎn)化率高、品質(zhì)優(yōu)良且產(chǎn)量較高的金針菇新菌株5-114，克服了親本采后基部易變褐的缺點(diǎn)，加快了育種過(guò)程，縮短了育種周期[33]。楊宗渠等用 60Co-γ 射線處理野生種馴化菌株F126F的雙核菌絲，經(jīng)過(guò)篩選培育出菌絲生長(zhǎng)快、抗雜力較強(qiáng)、產(chǎn)量高的金針菇新菌株輻金1號(hào)[34-35]。李蕤等通過(guò)對(duì)白金針2號(hào)菌絲進(jìn)行機(jī)械破碎，獲得了菌絲斷片單細(xì)胞懸液，利用紫外線及亞硝酸對(duì)其誘變，并利用透明圈法測(cè)定正變率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同菌齡菌絲斷片對(duì)紫外線的敏感性較亞硝酸低，2種處理中較高的正變率都出現(xiàn)在平臺(tái)期之后，即亞硝酸誘變時(shí)間40～50 s，紫外線誘變時(shí)間120～140 s，傳代試驗(yàn)證明，獲得的突變株遺傳性狀較穩(wěn)定[36]。羅潤(rùn)以黃色金針菇菌株FV7為材料，采用紫外線、氯化鋰和甲基磺酸乙酯（EMS）等多種誘變方法對(duì)金針菇的菌絲細(xì)胞進(jìn)行誘變，誘變后的菌絲細(xì)胞經(jīng)過(guò)菌絲體生長(zhǎng)階段 33 ℃ 高溫初篩和子實(shí)體發(fā)育階段20 ℃中溫復(fù)篩，獲得耐高溫突變菌株FV7EMS，該菌株生長(zhǎng)速度快、菌柄較長(zhǎng)，生物學(xué)效率較系本FVT提高28.82%[37]。

誘變育種通過(guò)誘使金針菇野生菌株或者栽培菌株發(fā)生變異，從中篩選出生長(zhǎng)期短、產(chǎn)量高、品質(zhì)好的菌株，多采用金針菇的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，但誘變育種只擴(kuò)大了變異范圍，并不能定向誘變，篩選工作將會(huì)十分繁瑣，誘變率也偏低，且誘變性狀不夠穩(wěn)定，容易引起長(zhǎng)出畸形菇。

2.4 原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體就是在人工條件下人為去除細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞。19世紀(jì)末Hanstein最早提出原生質(zhì)體的概念，原生質(zhì)體具有完整新陳代謝功能，可完成所有生命活動(dòng)，是由細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核組成的有機(jī)整體[38]。隨著對(duì)原生質(zhì)體的不斷研究，在20世紀(jì)60年代誕生了原生質(zhì)體融合（protoplast fusion）技術(shù)，該技術(shù)可使不同遺傳類(lèi)型原生質(zhì)體的基因組進(jìn)行交換和重組，產(chǎn)生具有親代遺傳特性的全新品種[39]。原生質(zhì)體融合方法具有重組頻率高、受結(jié)合型限制較小、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整、重組體種類(lèi)多、有助于外源基因轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)。

原生質(zhì)體融合前首先要獲得原生質(zhì)體，起初人們使用超聲波和研磨等物理方法制備原生質(zhì)體，但這些方法對(duì)細(xì)胞損傷大，制備的原生質(zhì)體質(zhì)量不高[40]。隨后，酶技術(shù)和生物工程技術(shù)的發(fā)展為原生質(zhì)體的制備提供了新的方法，成為食用菌原生質(zhì)體制備的主要方法。目前，在食用菌領(lǐng)域酶解細(xì)胞壁使用的酶主要有幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、蝸牛酶、溶壁酶、溶菌酶等，不同食用菌的細(xì)胞壁組成不同，需要根據(jù)所要制備的原生質(zhì)體的種類(lèi)選擇不同的酶[41]。田娟等使用溶壁酶處理香菇和金針菇單核菌絲獲得原生質(zhì)體并進(jìn)行了原生質(zhì)體融合，從142個(gè)融合子中獲得17個(gè)能出菇的菌株[42]。除了酶的選擇外，菌齡、酶的濃度、穩(wěn)滲劑、酶解時(shí)間、培養(yǎng)基成分和溫度等都是影響原生質(zhì)體制備的重要因素[43-44]。有報(bào)道采用正交試驗(yàn)方法對(duì)影響金針菇原生質(zhì)體制備和再生的因素進(jìn)行了研究，為后續(xù)的金針菇原生質(zhì)體融合育種的研究提供了重要參考，該報(bào)道提供了金針菇原生質(zhì)體制備和再生的最佳體系[45]。金針菇的原生質(zhì)體融合以聚乙二醇（PEG）作為融合劑的化學(xué)法最常用[46]。在原生質(zhì)體融合后需要對(duì)融合子進(jìn)行篩選，融合子的篩選方法很多，需要根據(jù)試驗(yàn)材料和試驗(yàn)?zāi)康牟煌M(jìn)行篩選，抗藥性、熒光染色、營(yíng)養(yǎng)缺陷型和應(yīng)用原生質(zhì)體滅活都是較為常用的方法[47-48]。篩選出的融合子要進(jìn)行鑒定以確認(rèn)融合子的真實(shí)性，常用的融合子鑒定方法分為生物學(xué)鑒定和DNA分子標(biāo)記鑒定二大類(lèi)，其中生物學(xué)鑒定主要是拮抗作用和鎖狀聯(lián)合等特征的鑒定，分子標(biāo)記鑒定主要采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）標(biāo)記技術(shù)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）標(biāo)記技術(shù)和簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（ISSR）技術(shù)[49]。這些方法各自存在一定的局限性。鎖狀聯(lián)合為許多擔(dān)子菌菌絲所特有的一種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，香菇、金針菇和木耳等菌株的融合均可以鎖狀聯(lián)合作為判定的自然標(biāo)記，而雙孢蘑菇、草菇等卻不能使用該標(biāo)記[50-52]。RFLP技術(shù)雖然效果穩(wěn)定，但試驗(yàn)周期長(zhǎng)、方法復(fù)雜等不利因素限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用[49]。

2.5 基因工程育種

基因工程育種（genetic engineering）就是人為從某一供體生物中提取所需的目的基因，在離體條件下采用適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶切割后，將它與載體DNA分子連接起來(lái)一并導(dǎo)入到受體生物細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，從而選育出新物種?；蚬こ逃N是一種比常規(guī)育種優(yōu)越得多的定向育種新技術(shù)，可以通過(guò)跨屬親本或多親本的遞推融合和高通量篩選實(shí)現(xiàn)食用菌基因組改組，將所有親本中的優(yōu)良基因集合到食用菌子代細(xì)胞上[53]。

隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，金針菇的基因組及轉(zhuǎn)錄組陸續(xù)被測(cè)定，這對(duì)基因工程育種與分子輔助育種具有很大的參考作用。2011年，張光忠對(duì)金針菇單核菌株L11與W23的基因組進(jìn)行了測(cè)序，拼接和組裝后，根據(jù)基因組序列的差異區(qū)域，設(shè)計(jì)顯性的特異性片段擴(kuò)增區(qū)域（SCAR）標(biāo)記引物[54]。2013年，王威對(duì)金針菇L11與W23的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序，數(shù)據(jù)揭示了HD基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)規(guī)律，總體表現(xiàn)為在單核菌絲時(shí)期表達(dá)量偏低，當(dāng)質(zhì)配為雙核菌絲后，在雙核菌絲內(nèi)表達(dá)量明顯升高，發(fā)育出原基后，表達(dá)量持平或下降[12]。在金針菇L11基因組和H1123轉(zhuǎn)錄組序列測(cè)定以及基因注釋基礎(chǔ)上對(duì)金針菇淀粉酶家族基因及萜類(lèi)合成途徑中的關(guān)鍵基因進(jìn)行了信息分析[55-56]。劉建雨等對(duì)金針菇Dan3全基因組序列進(jìn)行了測(cè)定，得到了大小為 34.17 Mb 的基因組，并預(yù)測(cè)到8個(gè)參與α-氨基己二酸途徑的關(guān)鍵基因[57]。

作為基因工程育種的核心環(huán)節(jié)，目前在食用菌領(lǐng)域常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、電激法、限制酶介導(dǎo)法、PEG法等[58]。李巍等以白金針菇菌絲球?yàn)槭荏w材料，通過(guò)金針菇表達(dá)載體p139035S-bFGF，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）[59]。施樂(lè)樂(lè)等通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法，以金針菇菌絲球?yàn)槭荏w材料轉(zhuǎn)入含該內(nèi)源HMG-box轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)表達(dá)載體，并對(duì)1個(gè)內(nèi)源HMG-box轉(zhuǎn)錄因子fvhom1進(jìn)行了基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)量分析，獲得了1個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子[60]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是繼鋅指核酸酶（ZFNs）和類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）之后的新一代基因組編輯技術(shù)，其基本作用原理是通過(guò)向?qū)gRNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶Cas9切割目標(biāo)基因，形成DNA雙鏈斷裂缺口，再利用細(xì)胞自身的同源重組和非同源末端連接2種修復(fù)途徑，實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)編輯[61]。因其載體設(shè)計(jì)操作簡(jiǎn)單、編輯高效且通用性廣，已成為基因組定向改造和基因功能驗(yàn)證的重要方法。羅潤(rùn)等采用CRISPR/Cas9高效基因編輯系統(tǒng)，構(gòu)建了金針菇基因敲除載體及轉(zhuǎn)化體系[62]。劉建雨等構(gòu)建了FvCas9雙元表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化金針菇單核體Dan3，抗性篩選后顯示，Cas9基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到金針菇菌絲體中[63]。

3 展望

初期栽培的菌株均為野生馴化育成的菌株，我國(guó)有豐富的食用菌種質(zhì)資源，廣泛收集的不同地域和不同生態(tài)型菌株，可作為金針菇遺傳育種的原始資源，若用于大面積栽培，還須對(duì)野生種加以改良。雜交育種手段繁瑣費(fèi)事，但只限于種內(nèi)雜交，雜交育種的目的性和方向性都比較明確，仍然是目前培育金針菇新的優(yōu)良菌株的真正有效方法。誘變育種多采用金針菇的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，但誘變育種只擴(kuò)大了變異范圍，并不能定向誘變，篩選工作將會(huì)十分繁瑣，誘變率也偏低，且誘變性狀不夠穩(wěn)定，容易引起長(zhǎng)出畸形菇。原生質(zhì)體融合方法具有重組頻率高、受結(jié)合型限制較小、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整、重組體種類(lèi)多、有助于外源基因轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)?；蚬こ逃N以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，為面臨諸多問(wèn)題的食用菌常規(guī)育種提供了新的選擇。目的基因的獲取是基因工程育種的前提[64]，隨著各種測(cè)序技術(shù)和分析手段的不斷發(fā)展，目的基因的獲取不再困難。金針菇高效穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)建立，基因定點(diǎn)編輯的技術(shù)-CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用在酵母、煙曲霉、里氏木霉和稻瘟病菌等真菌中[65-68]，在金針菇上也已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用，這些都使金針菇的基因工程育種成為未來(lái)菌株改良的新途徑。

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