蘇逸菲,湯夢(mèng)怡,徐善東,李 強(qiáng),,*

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083; 2.北京林業(yè)大學(xué)理學(xué)院,北京 100083)

銅是動(dòng)植物體內(nèi)非常重要的微量元素,其在人體內(nèi)有許多生理功能,與人體的造血功能、抗氧化作用密切相關(guān)[1-2]。正常成年人體內(nèi)含銅量為80～150 mg,每日最低的銅攝取量為2～3 mg,缺乏或過剩都會(huì)引起生理功能障礙和疾病,可見,對(duì)食品中的微量元素銅進(jìn)行研究具有一定的重要性和必要性[3-5]。為避免缺銅,最重要的就是要充分保證膳食中有足夠銅的攝入,以滿足身體的需要。口蘑子實(shí)體中粗蛋白、粗脂肪、粗纖維等含量豐富;氨基酸種類齊全,含有鉀、鈉、鈣、鎂、銅、鐵、鋅、錳和硒等多種人體必需的礦質(zhì)元素,其中鎂、銅、鐵、鋅和硒的含量均高于其他常見食用菌子實(shí)體[6-7]。口蘑中的銅是人們獲取銅元素的重要來源,因此,檢測(cè)口蘑中的銅含量具有重要意義。

對(duì)于銅的測(cè)定,常規(guī)的檢測(cè)方法有:電化學(xué)分析法、原子吸收光譜法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法、分光光度法、原子熒光光譜法等[8-13]。分光光度法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)[14-17]。目前,已經(jīng)有許多顯色劑被設(shè)計(jì)合成并用來檢測(cè)銅離子。但是,很多報(bào)道的顯色劑分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,需要繁瑣的合成步驟[18-19]。因此,設(shè)計(jì)合成結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、選擇性好的顯色劑仍具有一定的挑戰(zhàn)性。

偶氮類試劑是目前光度法測(cè)定過渡金屬元素的高靈敏顯色劑,可與多種金屬離子發(fā)生顯色反應(yīng),常用于分光光度法測(cè)定金屬離子含量[20-21]。其中,雜環(huán)偶氮類顯色劑近年來發(fā)展迅速,合成的噻唑、吡啶及喹啉偶氮顯色劑測(cè)定銅的分光光度法研究已有較多報(bào)道[22-27]。而含羧酸偶氮類試劑用于光度法測(cè)定銅的研究卻較少。喬永生等[28]應(yīng)用該類試劑進(jìn)行光度法測(cè)定用于鋁合金中銅的光度分析,結(jié)果理想。為了擴(kuò)大含羧酸偶氮類試劑測(cè)定金屬離子的應(yīng)用范圍,探究這類顯色劑的分析性能和結(jié)構(gòu)之間的內(nèi)在聯(lián)系,本文合成未見報(bào)道的3,5-二甲酸-4′-羥基偶氮苯應(yīng)用分光光度法測(cè)定銅。

本文在合成3,5-二甲酸-4′-羥基偶氮苯的基礎(chǔ)上,采用IR、1H-NMR和MS確定了其組成和結(jié)構(gòu),并研究了其UV-Vis的光譜性質(zhì)。在研究確定3,5-二甲酸-4′-羥基偶氮苯與銅的顯色反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上,建立分光光度法測(cè)定口蘑中銅的含量的方法,以期為3,5-二甲酸-4′-羥基偶氮苯分光光度法在食品中銅檢測(cè)的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

口蘑 市售;5-氨基間苯二甲酸甲酯 上海澄紹生物科技有限公司;苯酚 北京篤信精細(xì)制劑廠;乙酸鈉、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、N-N二甲基甲酰胺、無水乙醇、鹽酸 北京化工廠;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

W-100型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;UV-2600型紫外可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;SHB循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城儀器廠;PB-10酸度計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;X-4B顯微熔點(diǎn)儀 上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司;330FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;JNM-ECA600型600M核磁共振譜儀 日本電子株式會(huì)社;New ultrafleXtreme MALDI TOF/TOF質(zhì)譜儀 德國(guó)布魯克公司;optima 8X00系列ICP光譜儀 珀金埃爾默股份有限公司。

圖1 3,5-二甲酸-4′-羥基偶氮苯的合成Fig.1 Synthesis of 3,5-dicarboxylic acid-4′-hydroxyazobenzene

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 Cu2+標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:稱取0.2144 g氯化銅于100 mL燒杯中,加入2.0 mL濃HCl、20 mL蒸餾水溶解移入100 mL容量瓶中,用蒸餾水定容備用;取備用溶液1.00 mL于100 mL容量瓶,用蒸餾水定容備用。其他金屬離子儲(chǔ)備液溶液配制:CaCl20.1776 g、Pb(NO3)20.5296 g、ZnCl20.2179 g、HgCl20.4344 g、AgNO30.2718 g、FeCl30.2595 g均按照上述銅離子溶液配制方法進(jìn)行配制。實(shí)驗(yàn)用金屬離子均為1.6×10-4mol·L-1硝酸鹽或氯化物的水溶液。

1.2.2 樣品前處理 口蘑(105±3) ℃下烘干10 h后粉碎,按照國(guó)標(biāo)中濕法消解步驟進(jìn)行消解[29]。稱取5.0000 g于帶刻度消化管中,加入10 mL 69%硝酸、0.50 mL 72%高氯酸,在可調(diào)式電熱爐上消解(120 ℃/0.5～1 h、升至180 ℃)。消解至冒白煙,消化液呈無色透明或略帶黃色,取出消化管,冷卻后用水定容至50 mL,制成樣液a,混勻備用。

1.2.3 顯色劑的合成與表征

1.2.3.1 顯色劑的合成 3,5-二-甲酸甲酯-4′-羥基偶氮苯的合成:5-氨基間苯二甲酸甲酯8.40 g(40 mmol)、NaNO223.1 g(44 mmol)、苯酚4.50 g(48 mmol)、乙酸鈉36.1 g(440 mmol),按照文獻(xiàn)[30]中的方法進(jìn)行合成。

3,5-二甲酸-4′-羥基偶氮苯的合成:取上述反應(yīng)所得3,5-二-甲酸甲酯-4′-羥基偶氮苯于圓底燒瓶中加入50 mL甲醇,60 mL 10% NaOH,在水浴鍋中50 ℃條件下反應(yīng)12 h,最后用37% 濃HCl調(diào)至pH=1,抽濾并用水洗滌,真空干燥(45 ℃、3 h)。得黃色固體,稱量并用顯微熔點(diǎn)儀測(cè)得其熔點(diǎn)。

1.2.3.2 顯色劑3,5-二-甲酸-4′-羥基偶氮苯的表征 紅外光譜:顯色劑與溴化鉀晶體(約1∶20 的重量比)一起磨細(xì)混勻,制成薄片,立即在330FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀上測(cè)定,掃描范圍400～4000 cm-1。

紫外光譜:顯色劑儲(chǔ)備液稀釋10倍,以無水乙醇做參比,用UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)在200～600 nm進(jìn)行光譜掃描。

核磁共振氫譜:將顯色劑溶于CDCl3中,封管,于JNM-ECA600型600 M核磁共振譜儀上測(cè)定。

質(zhì)譜:將顯色劑溶于CDCl3中,于New ultrafleXtreme MALDI TOF/TOF質(zhì)譜儀上測(cè)定。

1.2.4 條件的優(yōu)化

1.2.4.1 波長(zhǎng)選擇 稱取0.0040 g 3,5-二甲酸-4′-羥基偶氮苯,用乙醇溶液溶解在100 mL容量瓶中,配制1.40×10-4mol·L-1儲(chǔ)備液。吸取3.00 mL顯色劑于10 mL的比色管中,無水乙醇定容,以無水乙醇做參比在200～600 nm進(jìn)行光譜掃描,記錄在λ=320 nm處的吸收強(qiáng)度A0;吸取2.00 mL銅儲(chǔ)備溶液于10 mL的比色管中,加入pH=9.18的四硼酸鈉緩沖溶液1.00 mL,混勻后加入3.00 mL顯色劑,用無水乙醇定容,以無水乙醇做參比,在200～600 nm進(jìn)行光譜掃描。顯色劑與銅形成的物質(zhì)即為配合物。

1.2.4.2 顯色劑用量的選擇 在7只10 mL的比色管中依次加1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mL顯色劑,混勻后用無水乙醇定容至10 mL,以無水乙醇做參比,在分光光度計(jì)上測(cè)得其在320 nm處的吸光值。

1.2.4.3 其他金屬離子選擇性的考察 在7只10 mL的比色管中依次加入2.00 mL鉛、鋅、汞、銀、鐵、銅儲(chǔ)備溶液,3.00 mL顯色劑,加入四硼酸鈉溶液1.00 mL,用無水乙醇定容,以無水乙醇做參比,在200～600 nm進(jìn)行光譜掃描。

1.2.4.4 介質(zhì)酸度的選擇 配制鄰苯二甲酸氫鉀溶液(pH=4.0),混合磷酸鹽溶液(pH=6.86)和四硼酸鈉溶液(pH=9.18)三種緩沖溶液;配制0.01 mol·L-1的HCl和NaOH溶液。

在7只10 mL的比色管中依次加入2.00 mL銅儲(chǔ)備溶液、3.00 mL顯色劑,在酸度計(jì)pB-10的測(cè)量下分別用滴加鄰苯二甲酸氫鉀溶液(pH=4.00),混合磷酸鹽溶液(pH=6.86)和四硼酸鈉溶液(pH=9.18)調(diào)節(jié)pH4、5、6、7、8、9、10,以無水乙醇做參比,在分光光度計(jì)上測(cè)得其在320 nm處的吸光值,并且計(jì)算ΔA。

1.2.4.5 緩沖溶液用量的選擇 在7只10 mL的比色管中依次加入2.00 mL銅儲(chǔ)備溶液、3.00 mL顯色劑,再依次加入四硼酸鈉溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL,無水乙醇定容至10 mL,以無水乙醇做參比,在分光光度計(jì)上測(cè)得其在320 nm處的吸光值,并且計(jì)算ΔA。

1.2.4.6 配位比測(cè)定 在5只10 mL比色管中固定顯色劑用量，即移取3.00 mL顯色劑,通過改變兩者的摩爾濃度的組成比,分別設(shè)置顯色劑與銅離子濃度比為:2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2,即依次移取銅儲(chǔ)備液1.25、1.60、2.50、3.75、5.00 mL,然后再依次加入四硼酸鈉緩沖溶液1.0 mL,在分光光度計(jì)上測(cè)得其在320 nm處的吸光值,并且計(jì)算ΔA。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在7只10 mL比色管中,依次加入銅儲(chǔ)備溶液0.00、0.20、0.60、1.00、1.50、2.00、2.50 mL,加入3.00 mL顯色劑,1.0 mL pH=9.18的四硼酸緩沖溶液,混勻后用無水乙醇定容定容,以無水乙醇做參比,在分光光度計(jì)上測(cè)得其在320 nm處的吸光值,并且計(jì)算ΔA。做吸光度差值對(duì)銅濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出直線回歸方程。

1.2.5.2 檢出限、定量限及檢測(cè)重現(xiàn)性 檢出限:移取銅儲(chǔ)備溶液2.00 mL于10 mL的比色管中,然后依次加入3.00 mL的顯色劑,1.00 mL pH=9.18的四硼酸緩沖溶液,混勻后用無水乙醇定容定容,以無水乙醇做參比,在分光光度計(jì)上測(cè)得其在320 nm處的吸光值,并且計(jì)算ΔA,上述操作重復(fù)11次。檢出限=3.3σ/S，σ-響應(yīng)值的偏差，S-標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

定量限:用信噪比法確定定量限[31],定量限=10σ/S。

檢測(cè)重現(xiàn)性:用11次測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示檢測(cè)重現(xiàn)性(精密度)。

1.2.5.3 回收率的測(cè)定 取2只10 mL的比色管中依次移取待測(cè)樣液a 1.00 mL、3.00 mL顯色劑、四硼酸鈉溶液1.00 mL,在分光光度計(jì)上測(cè)得其在320 nm處的吸光值,并且計(jì)算ΔA,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度C1。然后再取2只10 mL的比色管中依次移取待測(cè)樣液a 1.00 mL、3.00 mL顯色劑、四硼酸鈉溶液1.00 mL,依次加入銅儲(chǔ)備液1.00、1.50 mL,無水乙醇定容至10 mL,以無水乙醇做參比,在分光光度計(jì)上測(cè)得其在320 nm處的吸光值,并且計(jì)算ΔA,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算加標(biāo)后濃度C2,上述操作重復(fù)操作3次?；厥章?%)=(C2-C1)×100/加標(biāo)濃度。

1.2.6 樣品測(cè)定 移取待測(cè)樣液a 3.00 mL置于比色管中,然后依次加入3.00 mL顯色劑,1.00 mL pH=9.18的四硼酸緩沖溶液,混勻后用無水乙醇定容,以無水乙醇做參比,在分光光度計(jì)上測(cè)得其在320 nm處的吸光值,并且計(jì)算ΔA,上述操作重復(fù)操作3次。計(jì)算樣品中銅含量。

移取待測(cè)樣液a 3.00 mL置于比色管中,無水乙醇定容,于ICP光譜儀中測(cè)定銅離子含量,重復(fù)測(cè)定三次,計(jì)算得樣品中銅含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

紅外譜圖、紫外譜圖用Origin 9.0制圖;文中折線圖均用Microsoft Excel制圖。試驗(yàn)結(jié)果以平均值的置信區(qū)間[32](置信度為95%)表示即：

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色劑的表征

最終得3,5-二-甲酸甲酯-4′-羥基偶氮苯9.70 g,產(chǎn)率92.0%,顯微熔點(diǎn)儀測(cè)得熔點(diǎn)為214.5～215.3 ℃。

2.1.1 紅外光譜 紅外光譜(KBr壓片,cm-1)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,3357 cm-1為羥基的伸縮振動(dòng)峰,3069 cm-1為苯環(huán)上碳?xì)滏I的伸縮振動(dòng)峰,1705 cm-1為羧基上-CO的伸縮振動(dòng)峰,1594、1503 cm-1為苯環(huán)骨架振動(dòng)峰,1458 cm-1為-N=N-的伸縮振動(dòng)峰,1214 cm-1為Ar-O伸縮振動(dòng)峰,850～600 cm-1苯環(huán)上碳?xì)滏I的彎曲振動(dòng)峰。由此可見該化合物中含有的官能團(tuán)有-OH、苯環(huán)、-COO-、-N=N-。

圖2 顯色劑的紅外圖譜表征Fig.2 IR spectrum of chromogenic reagent

2.1.2 紫外光譜 紫外可見光譜(乙醇為溶劑)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,λ=203 nm和λ=256 nm的峰值為苯環(huán)的E2吸收帶和B吸收帶,對(duì)應(yīng)苯環(huán)的π-π*躍遷。偶氮苯在近紫外區(qū)(～350 nm)有一個(gè)很強(qiáng)的吸收[18],偶氮苯類化合物的紫外可見吸收光譜會(huì)受到苯環(huán)上取代基的影響,吸收峰會(huì)紅移或者藍(lán)移。該顯色劑由于苯環(huán)上含有羧基和羥基兩種取代基,羥基與苯環(huán)構(gòu)成的共軛給電子效應(yīng)大于羧基的吸電子效應(yīng)導(dǎo)致顯色劑的最大吸收峰會(huì)紅移[33],所以本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中λmax=357 nm即為偶氮苯鍵的吸收峰,對(duì)應(yīng)n-π*躍遷,ε380 nm=1.7×105L·mol-1·cm-1。

圖3 顯色劑的紫外圖譜表征Fig.3 UV-vis spectrum of chromogenic reagent

圖4 顯色劑的質(zhì)譜圖Fig.4 MS spectrum of chromogenic reagent

2.1.4 核磁共振氫譜 核磁共振氫譜(以CDCl3為試劑,600 MHz)結(jié)果如圖5所示。圖5中共有4組峰,第一組峰ppm=8.56,單重峰,氫質(zhì)子類型為1個(gè)H,由于苯環(huán)上羧基的吸電子效應(yīng)使原本苯環(huán)上氫的位移移動(dòng)到8.56,如圖中1位置所示;第二組峰ppm=8.50,單重峰,氫質(zhì)子類型為2個(gè)H,由于羧基吸電子效應(yīng)以及偶氮鍵的給電子效應(yīng),使其化學(xué)位移比1號(hào)氫紅移,如圖中2位置所示;第三組峰ppm=7.88～7.91,兩重峰,氫質(zhì)子類型為2個(gè)H,由于共軛效應(yīng)以及苯環(huán)上相鄰位置上的氫使3號(hào)位置上的氫裂分形成兩重峰,如圖中3位置所示;第四組峰ppm=6.97～6.99,二重峰,氫質(zhì)子類型為2個(gè)H,由于相鄰碳上的氫使4號(hào)位置裂分成兩重峰,如圖中位置4所示。理論上酚羥基和羧酸根中的氫應(yīng)該出現(xiàn)在核磁圖譜中,可能由于溶劑中混入少量的堿中和了其中的氫離子。

圖5 顯色劑的核磁共振氫譜表征Fig.5 1H-NMR spectrum of chromogenic reagent

通過以上的波譜分析,充分證明了3,5-二甲酸-4′-羥基偶氮苯的合成。

2.2 檢測(cè)條件優(yōu)化

2.2.1 波長(zhǎng)選擇 本實(shí)驗(yàn)中配合物λmax=380 nm處,原顯色劑也有吸收,會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果有干擾。本研究中,根據(jù)顯色劑及顯色劑與Cu2+形成配合物的紫外吸收光譜的特點(diǎn),改選用λ=320 nm作為工作波長(zhǎng)。在該波長(zhǎng)下,配合物在λ=320 nm無吸收。因此,只要固定顯色劑的用量(一般為過量),先測(cè)得顯色劑在λ=320 nm處的吸光值A(chǔ)0,再測(cè)得加入Cu2+后在λ=320 nm處的吸光值A(chǔ)1,吸光度ΔA=A0-A1即表示為顯色劑與Cu2+的反應(yīng)的量。因此λ=320 nm處顯色劑的吸光度差值ΔA=A0-A1,可以作為Cu2+定量分析的依據(jù)。

圖6 顯色劑及其形成的Cu2+配合物的吸收曲線Fig.6 The absorption curve of the chromogenic reagent and the Cu2+ complex formed by chromogenic reagent

2.2.2 顯色劑用量選擇 中國(guó)藥典規(guī)定:紫外測(cè)定中,溶液的吸收度應(yīng)控制在0.3～0.7范圍內(nèi),定量分析靈敏度范圍好,低濃度的紫外吸收才呈線性[34]。圖7實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在此范圍內(nèi)選擇合適濃度即當(dāng)顯色劑添加量為3.00 mL時(shí),顯色劑濃度為4.00×10-5mol·L-1,吸收強(qiáng)度在此范圍內(nèi)。因此本實(shí)驗(yàn)中選擇顯色劑的用量為3.00 mL。

圖7 顯色劑添加量對(duì)吸光度差值的影響Fig.7 Effects of the amount of chromogenic reagent on the difference in absorbance

2.2.3 其他金屬離子選擇性的考察 圖8中可見,Ca2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+、Hg+、Ag+這幾種口蘑中常見的金屬離子和顯色劑的混合溶液與顯色劑本身的紫外吸收光譜基本一致,表明Ca2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+、Hg+、Ag+這幾種重金屬離子與顯色劑均沒有反應(yīng)。因?yàn)槿粜纬尚碌呐浜衔?其紫外吸收光譜應(yīng)該發(fā)生變化。故可以認(rèn)為以上金屬離子對(duì)于在320 nm處測(cè)定銅離子沒有干擾。

圖8 不同金屬離子與顯色劑反應(yīng)的吸收曲線Fig.8 Absorptions curves of different metal ions reacting with chromogenic reagent

2.2.4 介質(zhì)酸度的選擇 在pH4.0～10.0范圍內(nèi),研究了pH的變化對(duì)吸光度差值的影響。圖9實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在所研究的pH范圍內(nèi),顯色劑與Cu2+均能發(fā)生顯色反應(yīng),隨著pH的增大,配合物的產(chǎn)率也逐漸增大,并在pH為9.0時(shí),反應(yīng)體系的吸光度差值最大且基本穩(wěn)定?？赡艿脑?yàn)轱@色劑中的羧基在堿性條件下全部生成鈉鹽,有利于其與Cu2+配位[35]。因此,本實(shí)驗(yàn)選用pH為9.18的四硼酸緩沖溶液進(jìn)行測(cè)定。

圖9 介質(zhì)酸度對(duì)吸光度差值的影響Fig.9 Effects of medium acidity on absorbance difference

2.2.5 緩沖溶液用量的選擇 顯色劑本身是羧酸類物質(zhì),在與Cu2+的配位反應(yīng)中有H+放出,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,溶液的酸度會(huì)增大,酸度的增加會(huì)影響已生成配合物的穩(wěn)定性,也不能滿足指示劑變色要求的最適宜酸度范圍,導(dǎo)致產(chǎn)生很大的誤差,其反應(yīng)原理相似于EDTA滴定法測(cè)定金屬離子[36]。因此,在測(cè)定中必須加入適量的緩沖溶液。圖10實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)緩沖溶液用量在0.5～1.00 mL范圍內(nèi),吸光度差值隨著緩沖溶液用量的增加而增大。當(dāng)緩沖溶液用量大于1.00 mL時(shí),體系吸光度基本穩(wěn)定。所以,本實(shí)驗(yàn)選用四硼酸鈉緩沖溶液用量為1.00 mL進(jìn)行測(cè)定。

圖10 緩沖溶液用量對(duì)吸光度差值的影響Fig.10 Effects of buffer solution amount on absorbance difference

2.2.6 配合物絡(luò)合比的測(cè)定 固定顯色劑用量,在Cu2+濃度增加的過程中,顯色劑會(huì)與銅離子反應(yīng)使顯色劑濃度降低,導(dǎo)致顯色劑在320 nm處的ΔA增大。當(dāng)Cu2+濃度增大到與顯色劑完全反應(yīng)時(shí),顯色劑濃度降為0,ΔA達(dá)到最大。圖11實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)配位比為1∶1時(shí),ΔA最大且保持不變,說明體系中顯色劑已被銅離子所結(jié)合,即表明顯色劑和銅離子作用的結(jié)合比為1∶1。因此,顯色劑與銅離子的比例選擇為1∶1。

圖11 顯色劑與銅離子比例對(duì)吸光度差值的影響Fig.11 Effects of the ratio of chromogenic reagent to copper ion on the difference in absorbance

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以銅離子濃度為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo)如圖12所示,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,在0～2.50 μg·mL-1范圍內(nèi),銅離子濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系,符合比爾定律。標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=0.1696x+0.0237,R2=0.9921,摩爾吸光系數(shù)為4.3×104L·mol-1·cm-1。

圖12 顯色劑與銅離子反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.12 Standards curve of reaction between chromogenic reagent and copper ion

2.3.2 檢測(cè)限及檢測(cè)重現(xiàn)性 對(duì)2 μg·mL-1銅溶液進(jìn)行了11組平行測(cè)定,由表1可見,此方法對(duì)銅的檢測(cè)限為0.064 μg/L,SD值為0.003,RSD平均值為0.93%,表明本方法有良好的精密度。

表1 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 1 Reproducibility experiment result table

2.3.3 回收率的測(cè)定 為考察方法的可靠性,進(jìn)行了回收率試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)測(cè)定了兩組樣品,每組測(cè)定三次,由表3可見回收率在97.0%～101.3%之間,RSD為0.93%～1.50%,證明方法的準(zhǔn)確度可以滿足分析樣品的要求。

表3 樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3 Sample test result

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)口蘑中銅含量進(jìn)行了分光光度法檢測(cè)以及ICP光譜儀檢測(cè),結(jié)果見表2,其中分光光度法測(cè)得口蘑中銅含量為(5.95±0.20) mg/100 g,ICP光譜儀測(cè)得口蘑中銅含量為(5.89±0.07) mg/100 g,兩種方法測(cè)得口蘑中銅含量幾乎吻合,表明本實(shí)驗(yàn)中此方法可行。

表2 回收率的測(cè)定Table 2 Determination of the recoveries

3 結(jié)論

本文合成了一種新型偶氮顯色劑3,5-二甲酸-4′-羥基偶氮苯,并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。顯色劑與Cu2+生成配合物的最佳參數(shù)為:1.4×10-4mol·L-1的顯色劑3.00 mL,pH約為9.18的四硼酸鈉緩沖溶液1.00 mL,且顯色劑與Cu2+配比為1∶1(顯色劑可選擇性地識(shí)別Cu2+,兩者形成了1∶1的配合物)。由于實(shí)驗(yàn)中配合物與顯色劑的紫外可見光譜顯示兩者色差不大,根據(jù)配合物及顯色劑的紫外可見光譜的特征,創(chuàng)造性地選擇了320 nm為工作波長(zhǎng),間接地測(cè)定了Cu2+的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,銅(Ⅱ)的質(zhì)量濃度在0～2.5 μg·mL-1內(nèi)遵從比爾定律,R2=0.9921,摩爾吸光系數(shù)為4.3×104L·mol-1·cm-1,加標(biāo)回收率為97.0%～101.3%,RSD為0.93%～1.50%,用于口蘑中Cu2+的測(cè)定結(jié)果與ICP結(jié)果幾乎吻合,說明該法具有精密度高和準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn),有望推廣到其它食品中微量銅的測(cè)定。