秦偉斐，畢蕾靜，李 維，黃 霞

(重慶市血液中心 400015)

目前，根據(jù)我國(guó)2015版《血站技術(shù)操作規(guī)程》中獻(xiàn)血者血液傳染性標(biāo)志物篩查的規(guī)定，在實(shí)施核酸檢測(cè)(NAT)試劑批簽發(fā)之前，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)感染標(biāo)志物應(yīng)采用1次核酸檢測(cè)和2次酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)，ELISA檢測(cè)應(yīng)采用兩個(gè)不同生產(chǎn)廠家的試劑；實(shí)施NAT試劑批簽發(fā)之后，血清學(xué)方法和核酸方法即可各檢測(cè)1次。對(duì)于ELISA檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本可不再進(jìn)行NAT，直接視為該項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果不合格。然而，雖然采用2次ELISA檢測(cè)，仍可因“窗口期”、隱匿性感染、基因變異及檢測(cè)靈敏度不夠高等因素造成一定程度的漏檢[1-3]。NAT是直接檢測(cè)病毒核酸，視為降低血清學(xué)窗口期漏檢風(fēng)險(xiǎn)最直接、最可靠的方法[4]。本中心于2011年以科研項(xiàng)目的方式啟動(dòng)了部分獻(xiàn)血者核酸篩查項(xiàng)目的試點(diǎn)，2013年1月開啟對(duì)所有獻(xiàn)血者血液進(jìn)行NAT和血清學(xué)檢測(cè)并行的模式。為了評(píng)估正式啟動(dòng)獻(xiàn)血者核酸篩查后的效果，評(píng)價(jià)其在降低輸血相關(guān)感染風(fēng)險(xiǎn)和保障血液安全中的作用，作者對(duì)2013-2017年本中心無(wú)償獻(xiàn)血者血液篩查結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，重點(diǎn)分析核酸篩查的結(jié)果，包括對(duì)比分析Procleix ULTRIO Assay和Procleix ULTRIO Plus Assay試劑的檢測(cè)結(jié)果，以評(píng)估NAT在重慶獻(xiàn)血者血液篩查中的收益情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 (1)標(biāo)本來(lái)源：本中心2013-2017年共收集無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本667 398份，分別采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝血真空無(wú)菌采血管，有分離膠的試管采集8 mL用于NAT和無(wú)分離膠的試管采集5 mL用于ELISA檢測(cè)，標(biāo)本處理過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程執(zhí)行。(2)試劑與儀器：HBsAg檢測(cè)(英國(guó)索林、北京萬(wàn)泰)、HCV檢測(cè)(美國(guó)強(qiáng)生、上?？迫A、北京萬(wàn)泰)、HIV-1/2檢測(cè)(法國(guó)伯樂(lè)、上?？迫A)。NAT試劑：HBV、HCV、HIV(1型)NAT試劑盒及HBV、HCV、HIV-1鑒別探針試劑(西班牙Grifols公司)。全自動(dòng)樣品處理儀(Xan-Tus)；全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)(Microlab FAME24/20)；PROCLEIX TIGRIS 核酸檢測(cè)系統(tǒng)(西班牙Grifols)；EXL808酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-TEK)。

1.2方法

1.2.1檢測(cè)方法 用于ELISA檢測(cè)的5 mL標(biāo)本經(jīng)全自動(dòng)樣品處理儀加樣完成后，分別采用兩個(gè)不同廠家的試劑對(duì)同一項(xiàng)目在全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)上進(jìn)行檢測(cè)，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV1/2雙試劑2次ELISA檢測(cè)；同時(shí)，用于NAT檢測(cè)的8 mL標(biāo)本置于樣品架，在自動(dòng)生物安全開蓋機(jī)內(nèi)開蓋，采用單人份NAT，基于轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)的NAT法在Tigris 全自動(dòng)核酸分析系統(tǒng)上進(jìn)行HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA 3項(xiàng)聯(lián)檢測(cè)分析，對(duì)NAT聯(lián)檢呈反應(yīng)性的標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)一步鑒別檢測(cè)。

1.2.2結(jié)果判定 所有檢測(cè)結(jié)果判定依據(jù)嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書及標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。ELISA檢測(cè)時(shí)，當(dāng)同一檢測(cè)項(xiàng)目?jī)煞N試劑檢測(cè)結(jié)果均吸光度/臨界值(S/CO)≥0.8，則直接認(rèn)定該標(biāo)本為反應(yīng)性；如某一檢測(cè)結(jié)果S/CO≥0.8，則用同一廠家試劑再次雙孔復(fù)試，復(fù)試結(jié)果若任一孔S/CO≥0.8，則認(rèn)定為有反應(yīng)性，否則判為無(wú)反應(yīng)性。NAT檢測(cè)時(shí)，先用ULTRIO試劑進(jìn)行HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA檢測(cè)，聯(lián)檢有反應(yīng)性的標(biāo)本，則判為NAT有反應(yīng)性；再分別進(jìn)行HBV、HCV和HIV-1鑒別檢測(cè)，根據(jù)鑒別結(jié)果，判為某一項(xiàng)目的NAT有反應(yīng)性。最后，再根據(jù)ELISA檢測(cè)結(jié)果和NAT結(jié)果綜合判斷，NAT與ELISA均無(wú)反應(yīng)性的標(biāo)本為合格標(biāo)本；NAT與ELISA均有反應(yīng)性的標(biāo)本為陽(yáng)性標(biāo)本；NAT無(wú)反應(yīng)性而ELISA有反應(yīng)性的標(biāo)本為陽(yáng)性標(biāo)本，NAT有反應(yīng)性而ELISA無(wú)反應(yīng)性的標(biāo)本也為陽(yáng)性標(biāo)本。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，二者比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1ELISA與NAT結(jié)果呈反應(yīng)性情況 2013-2017年共667 398份無(wú)償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行了2次ELISA篩查和NAT聯(lián)檢反應(yīng)性，兩種檢測(cè)方法共檢測(cè)呈反應(yīng)性標(biāo)本10 125份，總的反應(yīng)性率為1.52%(10 125/667 398)。其中ELISA方法檢測(cè)呈反應(yīng)性標(biāo)本7 975份，反應(yīng)性率為1.19%(7 975/667 398)。NAT呈反應(yīng)性標(biāo)本5 979例，反應(yīng)性率為0.90%(5 979/667 398)。不同年份檢測(cè)總的反應(yīng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中2013、2014年檢測(cè)總的反應(yīng)性率分別為2.18%、2.12%；2015年開始采取了一系列改進(jìn)措施，具有反應(yīng)性的標(biāo)本明顯降低，2016年檢測(cè)總反應(yīng)性率僅為0.88%，為5年中的最低值，分別與2013、2014年比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2ELISA與NAT反應(yīng)性標(biāo)本分布情況 10 125份反應(yīng)性標(biāo)本中NAT與ELISA均有反應(yīng)性的標(biāo)本3 829份，占總反應(yīng)性標(biāo)本的37.82%(3 829/10 125)，NAT與ELISA均有反應(yīng)性率為0.57%(3 829/667 398)；NAT無(wú)反應(yīng)性而ELISA有反應(yīng)性的標(biāo)本4 146例，占總反應(yīng)性標(biāo)本的40.95%(4 146/10 125)，單反應(yīng)性率為0.62%(4 146/667 398)；NAT有反應(yīng)性而ELISA無(wú)反應(yīng)性的標(biāo)本2 150例，占總反應(yīng)性標(biāo)本的21.23%(2 150/10 125),單反應(yīng)性率為0.32%(2 150/667 398)。2016年開始采用新一代高靈敏度的Plus Assay試劑后，NAT+ELISA-明顯增高，2016年和2017年分別與其他年份比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ELISA和NAT結(jié)果見(jiàn)表2；2013-2017年核酸與ELISA檢測(cè)獲得的反應(yīng)性標(biāo)本中NAT+ELISA+、NAT-ELISA+、NAT+ELISA-的分布情況，見(jiàn)表3。

表1 不同年份ELISA篩查和NAT聯(lián)檢反應(yīng)性情況

a：P<0.05，與2013、2014年比較

表2 ELISA和NAT結(jié)果(份)

表3 NAT與ELISA檢測(cè)獲得的反應(yīng)性標(biāo)本分布情況

a：P<0.05，與2016、2017年比較

2.3NAT聯(lián)檢反應(yīng)性且ELISA檢測(cè)非反應(yīng)性標(biāo)本鑒別情況 2 150例單NAT反應(yīng)性標(biāo)本，共鑒別檢出反應(yīng)性標(biāo)本707份，鑒別率為32.88%(707/2 150)；其中HBV DNA反應(yīng)性標(biāo)本696份，HIV RNA反應(yīng)性標(biāo)本11份，無(wú)HCV RNA標(biāo)本鑒別檢出。NAT總確認(rèn)收益率為1.06‰(707/667 398)，其中HBV DNA確認(rèn)收益率為1.04‰，HIV RNA確認(rèn)收益率為0.02‰,見(jiàn)表4。

表4 單核酸聯(lián)檢反應(yīng)性標(biāo)本鑒別情況[份(‰)]

3 討 論

受血者感染輸血傳播病原體風(fēng)險(xiǎn)的大小與獻(xiàn)血人群病原體感染率、獻(xiàn)血者血液篩查方法及試劑敏感性、病原體特性、受血者個(gè)體免疫狀態(tài)等多種因素有關(guān)。獻(xiàn)血者血液篩查是保障血液安全的重要屏障。近幾十年來(lái)，隨著血液篩查試劑不斷升級(jí)換代，檢測(cè)設(shè)備更加精密和自動(dòng)化，檢測(cè)流程更加規(guī)范，血液安全水平明顯提高。更高靈敏度和特異度的NAT技術(shù)在我國(guó)獻(xiàn)血者血液篩查中已全面采用，目前尚缺乏對(duì)我國(guó)NAT應(yīng)用效果的全面評(píng)價(jià)。

近年來(lái)，本血液中心采用Procleix ULTRIO?System和兩種ELISA試劑同時(shí)對(duì)獻(xiàn)血者血液標(biāo)本檢測(cè)，5年共檢測(cè)血液標(biāo)本667 398例，總反應(yīng)性率為1.52%，高于其他地區(qū)報(bào)道[5]，NAT聯(lián)檢反應(yīng)性率為0.90%，也明顯高于國(guó)內(nèi)其他學(xué)者報(bào)道[6-7]，可能與不同地區(qū)人群的總體感染率有關(guān)。唐衛(wèi)國(guó)等[8]曾報(bào)告2000-2009年重慶市無(wú)償獻(xiàn)血者中，HIV感染率呈逐年上升趨勢(shì)，說(shuō)明重慶地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者血液安全保障工作壓力大。本研究結(jié)果顯示，近5年來(lái)ELISA反應(yīng)率和NAT聯(lián)檢反應(yīng)率整體呈下降趨勢(shì)，可能與近年來(lái)本中心在血液安全保障方面采取了一系列改進(jìn)措施有關(guān)，如與加強(qiáng)了獻(xiàn)血者獻(xiàn)血前宣傳教育，幫助獻(xiàn)血者進(jìn)行不適用獻(xiàn)血的自我排除；采用了更靈敏的獻(xiàn)血前篩查方法；逐步取消了互助獻(xiàn)血者等因素有關(guān)。

667 398份檢測(cè)樣本中，NAT與ELISA同時(shí)呈反應(yīng)性的標(biāo)本占總反應(yīng)性的37.82%，單NAT反應(yīng)標(biāo)本占總反應(yīng)性標(biāo)本的21.23%，單ELISA反應(yīng)性標(biāo)本占總反應(yīng)性標(biāo)本的40.95%。單NAT反應(yīng)標(biāo)本僅為0.32%，比呂蒙恩等[6]報(bào)道的0.44%略低；而ELISA單反應(yīng)性標(biāo)本反應(yīng)性率為0.62%。作者曾經(jīng)在對(duì)2015年獻(xiàn)血者HBV篩查結(jié)果分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，ELISA單反應(yīng)性的HBsAg反應(yīng)性標(biāo)本中，兩種ELISA試劑均有反應(yīng)性的標(biāo)本確證陽(yáng)性率為78.7%，單試劑反應(yīng)性的確證陽(yáng)性率僅為5.3%[9]，提示ELISA單試劑呈反應(yīng)性的標(biāo)本中存在相當(dāng)比例的假反應(yīng)性。但是，在阻斷輸血相關(guān)傳染性疾病的傳播中，ELISA檢測(cè)技術(shù)作為國(guó)家規(guī)定的血液篩查方法發(fā)揮著重要作用，尤其是ELISA和NAT兩種方法聯(lián)合檢測(cè)[10]，互為補(bǔ)充，為進(jìn)一步縮短“窗口期”發(fā)揮重要作用。

本研究NAT的鑒別結(jié)果顯示，2 150例單NAT反應(yīng)性標(biāo)本，共鑒別檢出反應(yīng)性標(biāo)本707份，其中HBV DNA反應(yīng)性標(biāo)本696份，HIV RNA反應(yīng)性標(biāo)本11份，無(wú)HCV RNA標(biāo)本鑒別檢出。NAT總確認(rèn)收益率為1.06‰，略高于呂蒙恩等[6]、YANG等[11]的報(bào)道結(jié)果；其中HBV DNA確認(rèn)收益率為1.04‰，明顯高于美國(guó)和歐洲等地區(qū)獻(xiàn)血者的HBV陽(yáng)性率，這與我國(guó)乙型病毒性肝炎(乙肝)流行率較高有關(guān)；HIV RNA確認(rèn)收益率為0.02‰，遠(yuǎn)高于林詩(shī)雅等[12]報(bào)道的30多萬(wàn)獻(xiàn)血者中鑒別檢出2例HIV；HCV RNA確認(rèn)收益率為0，與國(guó)內(nèi)大部分地區(qū)報(bào)道相一致。2017年本中心HBV DNA確認(rèn)陽(yáng)性率為1.63‰，明顯高于其他年份，這與近年來(lái)本中心采用了新一代具有更高靈敏度的Procleix ULTRIO Plus Assay試劑有關(guān)。另外，NAT單反應(yīng)性標(biāo)本中鑒別率僅為35.90%，而大部分的標(biāo)本未被鑒別檢出，這是單人份NAT中常遇到的問(wèn)題。未被鑒別檢出這部分NAT單反應(yīng)性標(biāo)本有可能是多方面原因所致。一方面是與本中心現(xiàn)在采用的NAT方法有關(guān)，LINNEN等[13]研究發(fā)現(xiàn)TMA技術(shù)會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果呈假陽(yáng)性；另一方面可能與標(biāo)本病毒載量較低，鑒別檢測(cè)時(shí)可能正好未吸取到病毒核酸而導(dǎo)致核酸鑒別假陰性有關(guān)。VERMEULEN等[14]曾報(bào)道NAT HBV反應(yīng)性標(biāo)本主要為隱匿性HBV感染，其次是窗口期HBV感染。高靈敏度檢測(cè)試劑的使用，可以提高鑒別確認(rèn)率，有利于提高對(duì)低病毒拷貝數(shù)HBV窗口期及隱匿性乙肝的檢出率。本研究結(jié)果顯示，本中心增加NAT應(yīng)用以來(lái)，成功阻止了696份HBV DNA陽(yáng)性和11份HIV RNA陽(yáng)性血液發(fā)往臨床,有效避免了經(jīng)輸血傳播該病毒的風(fēng)險(xiǎn)。本中心對(duì)其中的4份HIV RNA陽(yáng)性標(biāo)本的獻(xiàn)血者進(jìn)行了追蹤隨訪，確認(rèn)為“窗口期”感染標(biāo)本[15]。

綜上所述，在重慶地區(qū)獻(xiàn)血者血液篩查策略中增加NAT，可以極大地降低經(jīng)輸血傳播病原體的殘余風(fēng)險(xiǎn)，從而提高血液的安全性。