吳國才，楊志剛，李慶華，馬境志

(1.廣東省湛江中心人民醫(yī)院血液風(fēng)濕科 524000；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東湛江 524000)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是成人最常見的急性白血病，患病率在年輕人群中為2/10萬人～3/10萬人，老年群體則有所上升，為13/10萬人～15/10萬人[1-2]。隨著近年醫(yī)學(xué)研究及技術(shù)的進(jìn)步，給予患者規(guī)范化化療及采取造血干細(xì)胞移植等手段提高了臨床治愈率，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示治愈最高可達(dá)50%以上[3-4]。相關(guān)文獻(xiàn)提示AML的整個(gè)發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素參與過程，而在這個(gè)過程中，酪氨酸激酶受體通路起著一定的作用，研究顯示酪氨酸激酶受體通路會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的分化[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MS樣酪氨酸激酶3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)序列(FMS-like tyrosine kinease 3-internal tandem duplication，F(xiàn)LT3-ITD)與AML的治療反應(yīng)及預(yù)后有密切聯(lián)系[6]，而當(dāng)前對(duì)于該類型的AML患者免疫表型特點(diǎn)及臨床特征報(bào)道較少，作者選擇廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科2016年5月至2018年11月收治的140例AML患者，分析FLT3-ITD陽性與陰性患者的免疫表型及實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)變化，以為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科2016年5月至2018年11月收治的140例AML患者，其中男86例，女54例；年齡19～83歲，平均(47.73±3.58)歲。140例AML患者中FLT3-ITD陽性25例(陽性組)，其中男15例，女10例；年齡18～82歲，平均(46.33±2.87)歲。FLT3-ITD陰性患者115例(陰性組)，其中男71例，女44例；年齡為19～83歲，平均(47.73±3.58)歲。依據(jù)法國、美國和英國協(xié)作組(FAB)標(biāo)準(zhǔn)及世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)將140例AML患者進(jìn)行分型：M245例，M436例，M512例，M613例，余下34例形態(tài)不能分類。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均符合AML臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)所有納入者均通過骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)、染色體、基因突變等確診；(3)完全符合WHO、FAB相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；排除了急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)、骨髓增殖性腫瘤(MPN)、骨髓增生異常綜合征(MDS)等疾病轉(zhuǎn)化為的AML及治療相關(guān)白血病。

1.2方法

1.2.1FLT3-ITD基因檢測 在患者入院次日，抽取晨起空腹骨髓標(biāo)本5 mL，分離并取其上懸液，其中包含有1.0×107單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用DNA提取試劑盒(美國Pro-mega公司提供)提取受檢標(biāo)本的DNA，對(duì)標(biāo)本DNA的吸光度進(jìn)行測定，并調(diào)整標(biāo)本DNA水平為50 ng/mL，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增處理，所用引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[7]，使用含有Gold View核酸染色劑的2%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析后，采用TanonMP系統(tǒng)予以攝像并分析處理，若出現(xiàn)重疊329 bp條帶，則可以確定為FLT3-ITD突變陽性。

1.2.2免疫表型的檢測 取受檢者2 mL肝素抗凝骨髓液，隨后給予骨髓標(biāo)記染色處理，可應(yīng)用單克隆抗體(熒光素標(biāo)記)進(jìn)行染色，并應(yīng)用散點(diǎn)圖設(shè)門法流式細(xì)胞術(shù)(CD45/SSC雙參數(shù))檢測細(xì)胞免疫表型，分別檢測淋系和髓系抗原。

1.2.3化療方案 主要用藥包括高三尖杉酯堿、蒽環(huán)類藥物及阿糖胞苷等，若患者年齡超過60歲則在誘導(dǎo)治療時(shí)，注意藥物劑量的使用。臨床常備化療方案包括去甲氧柔紅霉素、柔紅霉素與高三尖杉酯堿分別聯(lián)合阿糖胞苷，對(duì)于部分呈低增生性白血病患者或者高齡患者，則選擇阿克拉霉素聯(lián)合阿糖胞苷與粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。對(duì)于FLT3-ITD基因陽性或者陰性的治療具體依據(jù)患者情況隨機(jī)選用。

1.2.4療效評(píng)價(jià) 依據(jù)血液病學(xué)診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)[8]，完全緩解(CR)：白血病的癥狀體征消失，血象中血紅蛋白(Hb)≥100 g/L(男)或90 g/L(女及兒童)，中性粒細(xì)胞絕對(duì)值(ANC)≥1.5×109g/L，血小板(PLT)≥100×109g/L，外周血無白血病細(xì)胞(LC)；骨髓象中原始粒細(xì)胞+早幼粒細(xì)胞(原始單核細(xì)胞+幼單核細(xì)胞或原始淋巴細(xì)胞+幼淋巴細(xì)胞)小于5%，紅系及巨核系正常。部分緩解(PR)：骨髓原始細(xì)胞5%～20%；或臨床、血象2項(xiàng)中1項(xiàng)未達(dá)CR標(biāo)準(zhǔn)者。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分率描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組AML患者的LC免疫表型比較 本研究中共檢測出CD7、CD13、CD14、CD15、CD11b、HLA-DR、CD33、CD34、CD38、CD16、CD117、CD11c、CD56及CD64共14個(gè)抗原，其中CD7、CD33、CD56及CD117存在異常表達(dá)；與陰性組患者比較，陽性組患者CD117表達(dá)率明顯降低，而CD7、CD33及CD56的表達(dá)率明顯升高，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組AML患者的LC免疫表型比較[n(%)]

2.2兩組AML患者的臨床特點(diǎn)比較 初診時(shí)，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)陽性組中17例患者(>50～100)×109/L，占比為68.00%，8例患者的外周血WBC>100×109/L，占比為32.00%；陽性組患者外周血WBC>100×109/L的比例明顯高于陰性組AML患者，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。17例陽性組患者的骨髓LC>80%，占比為68.00%，明顯高于陰性患者，兩組患者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而兩組患者的Hb及PLT水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組AML患者相關(guān)指標(biāo)比較[n(%)]

2.3兩組AML患者的臨床治療效果比較 陽性組患者中，3例患者在化療中死亡(死因?yàn)閲?yán)重感染或出血并發(fā)癥)，余下22例患者中，CR 6例(27.27%)；PR 3例(13.64%)；治療總反應(yīng)率為40.91%。陰性組患者中參與此次評(píng)價(jià)的共95例，CR 49例(51.58%)，PR 20例(21.05%)，治療總反應(yīng)率為72.63%(69/95)，陰性組患者的治療總反應(yīng)率明顯高于陽性組患者，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組AML患者的臨床治療效果比較[n(%)]

3 討 論

近年，相關(guān)研究證實(shí)在AML的發(fā)生及預(yù)后中，F(xiàn)LT3的相關(guān)基因突變類型發(fā)揮著重要作用。而在AML中，近膜區(qū)域的ITD突變是FLT3的最為常見的突變形式，國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，對(duì)于成人AML患者而言，F(xiàn)LT3-ITD的突變發(fā)生率最高為20.8%[8]，另外亦有研究及文獻(xiàn)報(bào)道FLT3-ITD的突變發(fā)生率高達(dá)31%以上[9-10]。本研究結(jié)果顯示在140例初診AML患者中，25例發(fā)生了FLT3-ITD的突變，與國內(nèi)其他文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似[11-12]。FLT3-ITD的突變發(fā)生率文獻(xiàn)報(bào)道存在差異可能與選擇的樣本量不同有關(guān)。

相關(guān)研究及報(bào)道提示，與FLT3-ITD突變陰性比較，F(xiàn)LT3-ITD突變陽性AML患者免疫細(xì)胞表型CD34與CD117均呈現(xiàn)低表達(dá)，而CD4、CD13、CD14、CD33及CD64的表達(dá)均較高[13]，本研究結(jié)果顯示，與FLT3-ITD突變陰性比較，F(xiàn)LT3-ITD突變陽性AML患者CD7、CD33及CD56呈高表達(dá)而CD117呈低表達(dá)，與該研究報(bào)道相符，由此提示FLT3-ITD陽性AML患者LC有明顯的免疫標(biāo)記異常情況發(fā)生。

PORT等[14]的研究中，對(duì)AML患者中的核仁磷酸蛋白1(NPM1)基因突變、FLT3-ITD突變、CD56陽性及高LC患者的完全緩解率、生存率進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明FLT3-ITD突變患者與CD56陽性患者的無事件生存率較相應(yīng)的陰性對(duì)照低，完全緩解率也相對(duì)較低，可見FLT3-ITD的突變及CD56的高表達(dá)與AML患者的預(yù)后較差有一定關(guān)聯(lián)性。本研究針對(duì)性比較了FLT3-ITD陽性與FLT3-ITD陰性患者的細(xì)胞免疫表型，結(jié)果顯示FLT3-ITD陽性患者的CD56呈高表達(dá)且明顯高于FLT3-ITD陰性患者，由此提示FLT3-ITD陽性AML患者預(yù)后不佳可能與CD56的高表達(dá)有關(guān)。有研究顯示，在部分AML患者中，LC表面出現(xiàn)了淋系抗原表達(dá)，其中CD7是淋系抗原中T淋巴細(xì)胞分化的重要標(biāo)志且主要表達(dá)于外周T淋巴細(xì)胞及胸腺細(xì)胞中[15]，有研究顯示，在AML患者中CD7的表達(dá)率為11.9%～33.5%，且FLT3-ITD突變AML患者的CD7呈高表達(dá)，證實(shí)AML患者的FLT3-ITD基因發(fā)生突變與CD7的高表達(dá)有直接關(guān)系[16]。本研究中，F(xiàn)LT3-ITD陰性患者的CD7表達(dá)較低，且明顯低于FLT3-ITD陽性患者，再次證實(shí)AML患者的FLT3-ITD基因突變與CD7的高表達(dá)有直接相關(guān)性。有文獻(xiàn)表明，F(xiàn)LT3-ITD陽性患者均有骨髓LC占比較高、外周血WBC高及完全緩解率較低的臨床特征[17]。本研究結(jié)果顯示，在初診時(shí)，F(xiàn)LT3-ITD陽性AML患者外周WBC>100×109/L及骨髓LC>80%的占比均高于FLT3-ITD陰性患者，同時(shí)結(jié)果顯示，F(xiàn)LT3-ITD陽性患者的治療反應(yīng)率明顯低于FLT3-ITD陰性患者，可見FLT3-ITD基因突變?cè)贏ML的整個(gè)發(fā)病及病情進(jìn)展過程中起著重要作用，加強(qiáng)對(duì)FLT3-ITD的研究，對(duì)于了解患者預(yù)后狀況有一定的意義和價(jià)值，同時(shí)可以指導(dǎo)臨床制訂合適的治療方案。

綜上所述，對(duì)AML患者FLT3-ITD基因型的免疫表型及臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行分析，表明FLT3-ITD陽性AML患者呈現(xiàn)出特異免疫表達(dá)異常，臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)有特殊性，對(duì)AML患者的臨床治療及預(yù)后有極為重要的意義。