李國煒，李海洋，成 超，桑志山，楊欽喜，賈 磊，溫欣慰

(1.貴州省貴陽市第一人民醫(yī)院肝膽外科 550002；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，貴陽 550004；3.四川大學(xué)華西廣安醫(yī)院肝膽外科，四川廣安 638000)

我國是全球肝癌的高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率和病死率均處于世界較高水平，預(yù)計(jì)未來的中國和世界肝癌發(fā)病人數(shù)和病死人數(shù)將逐漸增加[1]。雖然目前的外科技術(shù)有著突飛猛進(jìn)的發(fā)展，腫瘤的介入治療、放射治療、靶向治療、免疫治療及生物治療等在不斷崛起。但是肝癌的治療效果及預(yù)后仍不理想，術(shù)后腫瘤早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的主要原因[2]。由于肝癌發(fā)病隱匿，早期診斷困難，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)因出現(xiàn)轉(zhuǎn)移而失去根治性治療的機(jī)會。因此，進(jìn)一步闡明肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)作用機(jī)制將具有重要臨床意義。波形蛋白(vimentin，VIM)是一種豐富并高度保守的Ⅲ型中間纖維蛋白之一，近年的研究顯示VIM在不同的生理及病理狀態(tài)下顯現(xiàn)出復(fù)雜的生物學(xué)功能，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力關(guān)系密切[3]。本課題組在前期的試驗(yàn)中證實(shí)波形蛋白的高表達(dá)與肝癌的惡性程度及預(yù)后相關(guān)。本研究希望通過siRNA干擾技術(shù)，探討VIM與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，希望為治療原發(fā)性肝癌提供理論基礎(chǔ)及生物干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細(xì)胞MHCC97-H、MHCC97-L購于上海中喬新舟生物公司(來源ATCC),胎牛血清(FBS)、胰酶消化液(EDTA)購自美國Gibco公司。高效RIPA細(xì)胞裂解液購自索萊寶，Trizol試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司，VIM抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司。VIM siRNA(h)(sc-29522)、siRNA Dilution Buffer、siRNA Transfection Reagent、Control siRNA-A (sc-37007)、siRNA Transfection Medium、Control siRNA (Fluorescein Conjugate)-A(sc-36869)均購自美國Santa Cruz公司。Transwell小室購自美國Nunclon Surface公司。FastStart Unicersal SYBR Green Master (Rox)購自日本Takara Bio公司，cDNA反轉(zhuǎn)錄、cDNA合成(反轉(zhuǎn)錄)試劑盒購自美國賽默飛世爾科技(中國)有限公司。VIM引物由上海生工設(shè)計(jì)合成。CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自上海東仁化學(xué)科技有限公司。Matrigel基底膠購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)所需培養(yǎng)基按90%達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)+10% FBS+1%雙抗配制，細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。根據(jù)細(xì)胞生長情況，1～3 d更換培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長至85%以上即可進(jìn)行傳代。

1.2.2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分3組，實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染特異性VIM-siRNA干擾；陰性對照組：轉(zhuǎn)染非特異性Control siRNA-A；空白對照組：未加任何轉(zhuǎn)染。所需VIM-siRNA由美國 Santa Cruz公司設(shè)計(jì)并合成，篩選出一條具有干擾效果的VIM-siRNA片段，其上游序列:5′-AUG GAA GAG AAC UUU GCC G-3′,下游序列:5′-CGG CAA AGU UCU CUU CCA U-3′。按照siRNA Transfection Reagent試劑說明書進(jìn)行操作。

1.2.3Western blot 提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白水平，取樣品量與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液5X按照4∶1的比例加入1.5 mL EPP管混勻。置于100 ℃沸水加熱5 min，以充分變性蛋白。按每孔40 μg總蛋白上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜、封閉，孵化一抗、二抗、ECL發(fā)光，最后用AX-Ⅱ型X射線攝影暗匣曝光。圖片存于電腦，使用Image J軟件處理，對結(jié)果進(jìn)行灰度值分析,β-actin作為內(nèi)參對照,進(jìn)行半定量分析。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR) 提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行RNA水平測定，按cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA合成。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)FastStart Unicersal SYBR Green Master操作說明進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min變性1個(gè)循環(huán)，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸5 min 1個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。通過檢測樣本CT值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用2-△△CT法計(jì)算出目的基因mRNA的相對表達(dá)水平。VIM上游引物：5′-AGT CCA CTG AGT ACC GGA GAC-3′，下游引物:5′-GGG TGT CGA GGG AAA AAT AGG-3′，β-Actin上游引物：5′-CCT GGC ACC CAG CAC AAT-3′，下游引物:5′-GGG CCG GAC TCG TCA TAC-3′。

1.2.5CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于96孔板中，各組設(shè)置4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，0、24、48、72 h。在4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)各組加入總體積10%的CCK-8試劑，3 h后酶標(biāo)儀在下450 nm波長測定光密度(OD)值，將各測試孔OD值減去本底OD值(空白組對照，即只加培養(yǎng)基未接種細(xì)胞)，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率，存活率%=(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/(對照組-空白組)×100%，并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.6Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，經(jīng)胰酶消化，用含1%牛血清清蛋白(BSA)的DMEM培養(yǎng)基配成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個(gè)/mL。混勻按每孔加入Matrigel 50 μL鋪膠于Transwell膜小室，置于37 ℃ 30 min。取制備的細(xì)胞懸液1×105個(gè)/mL(配成200 μL)加入Transwell小室上室，下室加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基500 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h。經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)適當(dāng)清洗，多聚甲醛固定30 min，風(fēng)干。用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。PBS清洗，于顯微鏡下選取5個(gè)視野直接鏡下拍照觀察穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.2.7細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 將各組細(xì)胞按1×106個(gè)/孔接種到6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。用高壓消毒后100 μL槍頭垂直均勻在培養(yǎng)板中劃線。再PBS清洗劃下脫落的細(xì)胞3次，每孔加入2 mL無血清培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、24、48 h對細(xì)胞進(jìn)行觀察并拍照，劃痕修復(fù)率=(0 h劃痕距離-24 h或48 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.2.8熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況 熒光對照組[Control siRNA (Fluorescein Conjugate)-A]分別轉(zhuǎn)染MHCC97-H細(xì)胞和MHCC97-L細(xì)胞6 h后，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。

2 結(jié) 果

2.1Western blot檢測VIM在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞中的表達(dá) VIM在MHCC97-H細(xì)胞中表達(dá)水平(1.20±0.33)明顯高于MHCC97-L細(xì)胞表達(dá)水平(0.93±0.29),兩種細(xì)胞VIM表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩種細(xì)胞VIM表達(dá)，見圖1。

1：MHCC97-H；2： MHCC97-L

圖1 Western Blot檢測不同肝癌細(xì)胞VIM的表達(dá)

2.2MHCC97-H和MHCC97-C兩株細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況 暗視野下可見已轉(zhuǎn)染一包呈綠色熒光，同一視野明視野拍照對比，其轉(zhuǎn)染均達(dá)70%以上，見圖2。

A：MHCC97-H細(xì)胞；B：MHCC97-H細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后；C：MHCC97-L細(xì)胞；D：MHCC97-L細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后

圖2 MHCC97-H細(xì)胞和MHCC97-L細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況(×200)

2.3Western blot檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞VIM表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染后MHCC97-H細(xì)胞和MHCC97-L細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中VIM均有明顯下調(diào)，其抑制率分別為73.69%和69.43%，與相應(yīng)的陰性組及空白組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、4。

圖3 Western blot檢測VIM在各組細(xì)胞中的表達(dá)

a:P<0.05，與空白組和陰性組比較

圖4 VIM在各組細(xì)胞中的VIM表達(dá)水平比較

2.4qPCR檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞VIM mRNA的相對表達(dá)水平 qPCR檢測結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中VIM mRNA表達(dá)水平均明顯下調(diào)，與陰性組及空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。VIM mRNA在各組細(xì)胞中的相對表達(dá)水平比較，見圖5。

a:P<0.05，與陰性組和空白組比較

圖5 VIM mRNA在各組細(xì)胞中的相對表達(dá)水平比較

a:P<0.05,與陰性組和空白組比較

圖6兩種肝癌細(xì)胞各組細(xì)胞增殖能力比較

a:P<0.05,與陰性組和空白組比較

圖7 48 h時(shí)兩種肝癌細(xì)胞各組細(xì)胞增殖率比較

2.5兩種細(xì)胞CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 實(shí)驗(yàn)組中MHCC97-H細(xì)胞和MHCC97-L細(xì)胞的增殖能力均有不同程度抑制，轉(zhuǎn)染24～48 h時(shí)其抑制作用較為明顯，與相應(yīng)的陰性組和空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6、7。

2.6沉默VIM基因?qū)Ω鹘M細(xì)胞侵襲能力的影響 通過siRNA干擾技術(shù)沉默VIM基因后，兩種細(xì)胞的侵襲能力均被明顯抑制，實(shí)驗(yàn)組VIM-siRNA與陰性組和空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖8、9。

圖8 沉默VIM基因?qū)HCC97-H、MHCC97-L細(xì)胞侵襲能力的影響(Transwell×200)

a:P<0.05，與陰性組和空白組比較

圖9各組細(xì)胞Transwell侵襲試驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)比較

2.7各組細(xì)胞遷移能力比較 通過細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，在MHCC97-H細(xì)胞和MHCC97-L細(xì)胞中，沉默VIM后兩種細(xì)胞遷移能力均受抑制，實(shí)驗(yàn)組與對應(yīng)的陰性對照組、空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖10、11。

圖10 各組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)

a:P<0.05，與陰性組和空白組比較

圖11各組細(xì)胞劃痕修復(fù)率比較

3 討 論

我國是乙型病毒性肝炎(簡稱乙肝)大國，全球估計(jì)有57%的肝硬化和78%的肝細(xì)胞肝癌病例與乙肝或丙型病毒性肝炎(簡稱丙肝)病毒感染相關(guān)[4]。盡管原發(fā)性肝癌的診斷和治療已經(jīng)取得了進(jìn)展，但其預(yù)后仍然不盡人意。肝癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移仍是影響患者預(yù)后的主要原因。進(jìn)一步弄清楚肝癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)作用機(jī)制具有重要臨床意義。

在臨床上，腫瘤的早期診斷及預(yù)測預(yù)后對其治療至關(guān)重要。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，VIM在原發(fā)性肝癌組織中異常表達(dá)，癌組織中VIM表達(dá)遠(yuǎn)大于癌旁近、遠(yuǎn)組織(距癌組織2～5 cm、>5 cm)，其高表達(dá)與肝癌的TNM分期、病理分化、癌結(jié)節(jié)數(shù)量及轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)[5]，本研究認(rèn)為VIM的高表達(dá)對肝癌具有一定的促進(jìn)作用，VIM可以視為一種潛在的腫瘤標(biāo)志物[6-7]。關(guān)于這一點(diǎn)，在其他研究中也得到驗(yàn)證。有學(xué)者利用強(qiáng)效抗體V9抗原表位的精確測定VIM，在惡性腫瘤中具有高度特異性，作為促進(jìn)惡性腫瘤的診斷[8]。通過血清學(xué)檢測VIM，對小肝癌的診斷具有40.91%的靈敏度和87.50%的特異度[9]。

本研究選用兩種不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系，其轉(zhuǎn)移潛能MHCC97-H>MHCC97-L，MHCC97-H肺轉(zhuǎn)移能力為100%，MHCC97-L肺轉(zhuǎn)移潛能為40%[10]。通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)提示VIM的高表達(dá)可能促進(jìn)肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移。通過siRNA干擾技術(shù)能夠有效沉默VIM基因在MHCC97-H和MHCC97-L細(xì)胞中的表達(dá)，而且兩種細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力和遷移能力明顯下降，說明VIM的表達(dá)在肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中扮有重要的作用，并對腫瘤的靶向治療具有一定的臨床意義。關(guān)于其作用機(jī)制，目前尚不清楚。本課題組認(rèn)為這一現(xiàn)象與VIM本身的生物學(xué)功能密切相關(guān)，如調(diào)控細(xì)胞的黏附、遷移、細(xì)胞凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及血管生成等。

近年來，有研究顯示VIM參與細(xì)胞黏附及遷移的調(diào)控，可解釋在上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中，細(xì)胞運(yùn)動性增強(qiáng)、黏附性減弱及細(xì)胞形態(tài)改變，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤侵襲能力的增強(qiáng)[11]。此外，VIM具有促進(jìn)血管生成作用和介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞收縮力的調(diào)節(jié)[12-13]，同時(shí)也可參與調(diào)節(jié)血管生成的平衡[14]。而部分信號分子是可以通過調(diào)節(jié)VIM來促進(jìn)肝細(xì)胞癌中的細(xì)胞增殖和侵襲，如長的非編碼RNA GAS5[15]，說明VIM可以作為部分信號通路的信號分子參與腫瘤的發(fā)展過程。有學(xué)者認(rèn)為，VIM可能是通過鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)VAV2介導(dǎo)的Rac1激活，促進(jìn)黏著斑激酶(FAK)的穩(wěn)定，使癌細(xì)胞更具運(yùn)動性和侵襲性[16]。

本研究結(jié)果表明，VIM與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。VIM的高表達(dá)與肝癌惡性程度及預(yù)后呈正相關(guān)，具有一定的臨床指導(dǎo)意義。進(jìn)一步闡明VIM與肝癌相關(guān)信號的作用機(jī)制，對于研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及研發(fā)阻斷腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的靶向藥物具有重要意義。