祝 文，崔 鳳，程志堅(jiān)△，賀西京

(1.陜西省咸陽市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 710021；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨科 710004)

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用越來越受到研究者的重視[1-2]，尤其是以炎性反應(yīng)為主的病理變化，其在抗感染和免疫調(diào)節(jié)中均起著非常重要作用[3-5]。巨噬細(xì)胞主要來源骨髓，如何分離、原代培養(yǎng)獲得高純化骨髓來源的巨噬細(xì)胞，并充分了解其生長特性，是體外研究巨噬細(xì)胞功能的首要任務(wù)。目前，關(guān)于骨髓來源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)相對成熟，但是關(guān)于培養(yǎng)過程中其標(biāo)志物及增殖能力情況鮮見具體描述。本研究擬以小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞研究對象，重點(diǎn)探索培養(yǎng)不同時間點(diǎn)細(xì)胞表達(dá)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物和增殖動態(tài)情況，給以巨噬細(xì)胞為靶點(diǎn)的相關(guān)后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物和細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)所使用的實(shí)驗(yàn)動物是SPF級6～8周齡成年昆明小鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。小鼠成纖維細(xì)胞株L929購自中科研究細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑和儀器 培養(yǎng)基高糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、胰酶購自美國GIBCO公司，新生牛血清(NCS)購自美國Cellgro公司，大鼠抗小鼠 F4/80 抗體、5′-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)增殖檢測試劑盒購自美國Abcam公司,相應(yīng)的山羊抗大鼠Alexa Fluor 488染料標(biāo)記的熒光二抗購自美國Life technologies公司,紅色熒光beads、Hoechst33342熒光染料購自美國Sigma公司，熒光顯微鏡日本尼康公司，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。

1.2方法

1.2.1L929細(xì)胞培養(yǎng)及其上清液的收集 L929細(xì)胞培養(yǎng)于含10% NCS的DMEM(高糖)培養(yǎng)液約7 d后，收集培養(yǎng)上清液，3 500 r/min 4 ℃離心30 min，去除沉淀(即細(xì)胞碎片)，然后用0.45 μm濾器過濾后，所得液體為含集落刺激因子(colony-stimulating factor，CSF)-1的培養(yǎng)液，用于配制骨髓來源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液，分裝后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2骨髓內(nèi)細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 將6～8周齡昆明小鼠處死后，無菌條件下取其股骨及脛骨置于預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中。轉(zhuǎn)移于超凈臺內(nèi)，全程于冰袋上操作。剔除周圍的肌肉組織，然后將兩端干骺端去除，用巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液將骨髓從髓腔中沖洗出，并將其吹打成均勻的單細(xì)胞懸液，以(1～3)×107個/皿的密度接種于10 cm Petri培養(yǎng)皿中。細(xì)胞所用培養(yǎng)基為：DMEM+15%L929上清液+5%NCS+1%青霉素鏈霉素(Gibco,15140122)置于37 ℃孵箱中培養(yǎng)。從接種時開始，每隔3 d全量換培養(yǎng)液。

1.2.3F4/80細(xì)胞免疫熒光染色 按照培養(yǎng)1、3、5、7 d不同時間點(diǎn)收集相應(yīng)細(xì)胞爬片并固定，然后用1%牛血清清蛋白(BSA)+0.3% Triton X-100封閉1 h，分別加大鼠抗F4/80抗體(1∶400)，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌5 min×3次，二抗Alexa Fluor?488山羊抗大鼠抗體(1∶600)，室溫、避光孵育1 h并使用Hoechst33342(1∶1 000)染核5 min，PBS洗滌后封閉、熒光顯微鏡觀察并分析結(jié)果。

1.2.4吞噬實(shí)驗(yàn) 檢測培養(yǎng)7 d后巨噬細(xì)胞吞噬功能,加入 Beads 1 h后洗滌、固定、熒光顯微鏡拍照并分析結(jié)果。

1.2.5EdU標(biāo)志法檢測增殖情況 固定標(biāo)本前2 h添加10 mmol/L EdU孵育細(xì)胞，再固定、破膜30 min，然后根據(jù)說明配制EdU反應(yīng)溶液，避光反應(yīng)30 min，染核、洗滌、封片、觀察及分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 獲取的小鼠骨髓細(xì)胞在含15%L929上清液巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞在顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)不均一，可呈棱形、短桿狀或橢圓形等(圖1A)，利用免疫熒光染色可觀察到所獲得細(xì)胞的巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80陽性率高達(dá)95%(圖1B)，且具吞噬能力，見圖1C。

2.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞F4/80及EdU陽性細(xì)胞表達(dá)比較 骨髓細(xì)胞在含15%L929上清液的培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d后可獲得高純度的巨噬細(xì)胞(即F4/80陽性細(xì)胞)，培養(yǎng)1、3、5、7 d后細(xì)胞F4/80陽性細(xì)胞率分別為(1.52±0.39)%、(17.95±2.36)%、(75.57±6.17)%、(95.49±9.83)%，各時間點(diǎn)F4/80陽性細(xì)胞率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((1 dvs. 3 d、3 dvs. 5 d、5 dvs.7 d)，P<0.05)；培養(yǎng)1、3、5、7 d后細(xì)胞EdU陽性細(xì)胞率分別為(2.13±0.33)%、(4.61±0.54)%、(18.02±2.19)%、(28.84±3.15)%，各時間點(diǎn)EdU陽性細(xì)胞率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1 dvs.3 d、3 dvs.5 d、5 dvs.7 d，P<0.05)。隨著培養(yǎng)時間延長，F(xiàn)4/80及EdU陽性細(xì)胞表達(dá)率逐漸升高，見圖2、3。

A：巨噬細(xì)胞形態(tài)；B：F4/80陽性表達(dá)；C：細(xì)胞吞噬能力

圖1顯微鏡下觀察培養(yǎng)7 d的巨噬細(xì)胞形態(tài)F4/80陽性表達(dá)及吞噬能力(×100)

圖2 不同時間點(diǎn)體外培養(yǎng)細(xì)胞F4/80免疫熒光染色結(jié)果(×100)

圖3 不同培養(yǎng)時間骨髓細(xì)胞EdU免疫熒光染色結(jié)果(×100)

3 討 論

巨噬細(xì)胞分布在全身，其分為組織內(nèi)巨噬細(xì)胞和外周循環(huán)的巨噬細(xì)胞。在正常生理狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞監(jiān)視組織內(nèi)環(huán)境，如吞噬病原體維持組織穩(wěn)態(tài)，吞噬死亡細(xì)胞，對局部環(huán)境的變化會做出迅速的反映。許多疾病如脊髓損傷、腫瘤、動脈粥樣硬化、哮喘都與巨噬細(xì)胞息息相關(guān)，其也是主要治療靶點(diǎn)[3,6]。因此，巨噬細(xì)胞是研究細(xì)胞免疫、分子免疫學(xué)等方面的重要對象。充分了解巨噬細(xì)胞生長特性是體外研究巨噬細(xì)胞功能的重要任務(wù)之一，目前關(guān)于骨髓來源的巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中其標(biāo)志物及增殖能力情況鮮見報道。

本研究中關(guān)注小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)及培養(yǎng)過程中不同時間點(diǎn)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)和增殖能力動態(tài)變化情況，F(xiàn)4/80是常用巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，主要表達(dá)于細(xì)胞膜[7]。骨髓細(xì)胞在15%L929上清液的培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d后，經(jīng)鑒定其表達(dá)F4/80,并且具有吞噬能力，說明骨髓來源的巨噬細(xì)胞在體外成功培養(yǎng)，并且其純度高，可滿足實(shí)驗(yàn)條件，為以后進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞在腫瘤、纖維化等疾病中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。培養(yǎng)1、3、5、7 d不同時間點(diǎn)F4/80陽性細(xì)胞率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),隨著培養(yǎng)時間延長，F(xiàn)4/80陽性率逐漸升高，并在培養(yǎng)7 d達(dá)到(95.49±9.83)%。由此可見體外誘導(dǎo)時間是獲得高純度巨噬細(xì)胞的必要條件，一般要至少培養(yǎng)7 d，不能提前使細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)論。因此，以巨噬細(xì)胞為研究對象時，需要保持培養(yǎng)時間恒定，才能獲得相對一致結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過7 d誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)多樣，有著突起和偽足，符合體內(nèi)巨噬細(xì)胞的特征，結(jié)合F4/80染色結(jié)果顯示，體外經(jīng)過含15%L929上清液誘的培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d能夠成功獲成熟的巨噬細(xì)胞。目前，用于巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)大多是直接使用重組的巨噬細(xì)胞CSF，但對于需要大量培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的課題如外泌體的分離等，則花費(fèi)較大。而L929可以分泌大量CSF-1,使用L929上清液進(jìn)行巨噬細(xì)胞培養(yǎng)具有獲取簡單、花費(fèi)少、方便保存等優(yōu)點(diǎn)。

過去認(rèn)為組織中的巨噬細(xì)胞是已經(jīng)分化成熟的終末細(xì)胞，不再具備增殖能力[8]。最新研究表明，巨噬細(xì)胞的原位增殖現(xiàn)象不僅僅在Th2型炎性反應(yīng)發(fā)生過程中[9-11]，在其他巨噬細(xì)胞極化過程也可觀察到巨噬細(xì)胞原位增殖現(xiàn)象，如肥胖造成的慢性炎癥過程中[12]，以及動脈粥樣硬化的發(fā)生過程中[13]，均觀察到原位增殖巨噬細(xì)胞的存在。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在DNA復(fù)制時期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在合成的DNA分子中，通過基于Apollo?熒光染料與EdU的特異性反應(yīng)即可直接并準(zhǔn)確地檢測出DNA復(fù)制活性。有研究發(fā)現(xiàn)，通過檢測EdU標(biāo)記便能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞增殖情況[14-15]。本課題組的研究結(jié)果表明，培養(yǎng)7 d后獲得骨髓來源的巨噬細(xì)胞部分表現(xiàn)EdU陽性，具有增殖能力?？梢婓w外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可能存在兩種來源：骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)成熟和巨噬細(xì)胞自身增殖，本研究發(fā)現(xiàn)將給后續(xù)研究工作提供新的方向，下一步將對具有增殖能力的巨噬細(xì)胞進(jìn)行分選和功能研究。

綜上所述，利用含L929上清液的培養(yǎng)液經(jīng)7 d誘導(dǎo)培養(yǎng)后，可從骨髓中獲得高純度的巨噬細(xì)胞，并且具有較強(qiáng)的增殖能力。