王澤夏，封 燁，劉 菲，余良主，李敏才△，胡美純

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧 437100；2.信陽農(nóng)林學(xué)院，河南信陽 464006)

膠質(zhì)瘤是一種常見的原發(fā)性腦腫瘤，包括星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)瘤和室管膜瘤。多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是所有腫瘤中最具侵襲性的實(shí)體瘤之一，預(yù)后極差。分化不良的GBM具有細(xì)胞形態(tài)多樣性、核異型性、核分裂活躍，組織學(xué)特征表現(xiàn)為壞死、血管增生和血栓形成等形態(tài)學(xué)特征[1]。目前的治療方式有腫瘤切除、化療、放療及抗血管類靶向藥物治療等；由于GBM的特殊性，尋找新的治療方法或更好的藥物具重要意義。姜黃素[1,7-二(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮，Curcumin]是從姜黃屬植物粉末狀根莖中分離得到的一種天然多酚類化合物[2]，這種化合物對人類疾病，如炎癥性疾病和神經(jīng)退行性疾病具有積極的治療作用[3-4]。有研究表明，姜黃素對肝癌、乳腺癌具有抑制增殖、調(diào)節(jié)信號通路等多種作用[3]。蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，又稱Akt，參與細(xì)胞存活、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖生長等多種生物學(xué)作用[5]。Akt受到外部信號刺激時，磷酸化Akt(p-Akt)與許多底物的相互作用體現(xiàn)其調(diào)節(jié)功能。有文獻(xiàn)報(bào)道姜黃素能通過調(diào)節(jié)Akt促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡[6]。Akt功能還受到其他因素的拮抗作用，如人第10號染色體缺失磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin nomolog deleted on chromosome ten,PTEN)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)和同源盒結(jié)構(gòu)基因(homeobox gene，HOX)B9的調(diào)節(jié)[7]。PTEN是抑癌基因，PTEN蛋白可以抑制Akt及其下游激酶的活性，從而抑制腫瘤生長和促進(jìn)凋亡[8]。姜黃素在GBM中的研究報(bào)道較少，本研究探討姜黃素對GBM的增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，進(jìn)一步揭示對Akt及相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)制，以為姜黃素臨床藥理作用提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞株為研究模型。主要相關(guān)試劑：姜黃素購自美國Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自碧云天生物技術(shù)研究所；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素購自美國Gbico公司；Matrigel膠購自美國Corning公司；Hoechst細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物科技公司；Akt抗體(C67E7)購自美國CST公司；p-Akt抗體(bsm-33281M)購置北京博奧森生物技術(shù)有限公司；PTEN抗體(D3Q6G)購自美國CST公司；GAPDH抗體(sc-32233)購自美國Santa Ctuz公司；Akt抑制劑(Quercetin)購自美國Selleck公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞培養(yǎng)于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)基為高糖DMEM含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素，待細(xì)胞長滿至90%時進(jìn)行傳代，取細(xì)胞對數(shù)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT增殖實(shí)驗(yàn) 將U251細(xì)胞消化后調(diào)整細(xì)胞密度至8×104個/mL，按每孔100 μL加至96孔板中并放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。吸去原培養(yǎng)基，加入DMEM高糖培養(yǎng)基100 μL，設(shè)6個姜黃素濃度[0(對照組)、5、10、20、30、40 μmol/L]，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱使藥物分別作用24、48、72 h。作用時間結(jié)束后將細(xì)胞板取出，每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL)，放置培養(yǎng)箱4 h后取出。吸去96孔板中的液體，每孔加入DMSO 150 μL，室溫反應(yīng)15 min后放置酶標(biāo)儀中，使用490 nm進(jìn)行吸光度(OD)的測定。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-對照組OD值)/對照組OD值，設(shè)定對照組存活率為1。

1.2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 消化后U251細(xì)胞鋪至6孔板內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至90%～95%時，使用黃槍頭輕輕地在6孔板底部劃一條線。棄去原培養(yǎng)液，分別加入含0(對照組)、10、20 μmol/L的姜黃素培養(yǎng)液，放置培養(yǎng)箱12 h后，棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)潤洗2次，4%多聚甲醛固定10 min后拍照。細(xì)胞遷移率=(初始細(xì)胞間隙-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞間隙)/(初始細(xì)胞間隙-對照組細(xì)胞間隙)，設(shè)定對照組遷移率為1。

1.2.4細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 在冰上將Matrigel膠與DMEM培養(yǎng)基按1∶2比例混合后按每孔30 μL加至96孔板相應(yīng)位置中，放置培養(yǎng)箱內(nèi)1 h。用10 μmol/L姜黃素濃度預(yù)作用24 h后調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105個/mL，每孔加入100 μL,每組設(shè)3個復(fù)孔。將96孔板放置培養(yǎng)箱90 min后取出，去培養(yǎng)基PBS潤洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色5～6 min，PBS洗去多余結(jié)晶紫。每組拍照結(jié)果進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞黏附率=姜黃素組細(xì)胞數(shù)/對照組細(xì)胞數(shù)。設(shè)定對照組黏附率為1。

1.2.5細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 在冰上將Matrigel膠與DMEM按1∶2比例混合后按每孔30 μL加至Transwell小室中，同24孔板一起放置培養(yǎng)箱1 h，取出后將未凝固的Matrigel膠吸走。將事先饑餓24 h的細(xì)胞消化后并調(diào)整細(xì)胞密度為6×105個/mL。設(shè)3個姜黃素濃度組[0(對照組)、10、20 μmol/L]，每組做3個平行組。上室加入100 μL細(xì)胞和100 μL含相應(yīng)藥物濃度的DMEM無血清培養(yǎng)基。下室加入相對應(yīng)藥物濃度的含血清DMEM培養(yǎng)基。放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取出棄去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10 min，用棉簽輕輕擦去未穿過Matrigel膠的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，PBS洗去多余結(jié)晶紫，待干燥后拍照。每組拍照結(jié)果進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲率=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)/對照組細(xì)胞數(shù)。設(shè)定對照組侵襲率為1。

1.2.6細(xì)胞Annexin V-FITC/PI雙染凋亡實(shí)驗(yàn) 將無菌的細(xì)胞爬片提前放置在24孔板內(nèi)，把消化的細(xì)胞調(diào)整密度至3.5×105個/mL，以每孔500 μL加入至24孔板中過夜。棄除培養(yǎng)基，加入分別含0(對照組)、10、20 μmol/L的姜黃素培養(yǎng)基并放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出后棄除培養(yǎng)基，PBS潤洗2遍后加入Hoechst染色液染色5 min；PBS潤洗2次，每孔加入400 μL Annexin V結(jié)合液，再加入5 μL Annexin V-FITC染色液和10 μL PI染色液，混勻，避光室溫反應(yīng)10 min，PBS潤洗2次。取出爬片，將有細(xì)胞面的爬片貼于含有抗熒光淬滅劑的載玻片上，將載玻片置于正置熒光顯微鏡上，使用UV激發(fā)光拍攝Hoechst染色的細(xì)胞(細(xì)胞核)；使用Blue激發(fā)光拍攝Annexin V染色的細(xì)胞(早期凋亡)；使用Green激發(fā)光拍攝PI染色細(xì)胞(晚期凋亡或壞死)。

1.2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 將10 μmol/L姜黃素及20 μmol/L Akt抑制劑(Quercetin)作用24 h的細(xì)胞取出置于冰上。配制裂解液工作液[加強(qiáng)型放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、磷酸化蛋白酶抑制劑、Cocktail]。用PBS潤洗細(xì)胞2次，吸去多余PBS；加入適量裂解液工作液靜置10 min使其細(xì)胞充分裂解，使用細(xì)胞刮刀刮下后再靜置5 min；將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中離心(12 000 r/min，4 ℃，15 min)，取上清液，使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白水平并定量；加入相對應(yīng)體積的5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) Loading buffer置于100 ℃水浴鍋中煮沸7 min。按照配方制備凝膠，并再每孔加入等體積樣品，并保證每孔蛋白不低于50 μg；使用80 V電泳至分離膠后改120 V電泳至底部。將預(yù)先在甲醛浸泡10 min的聚偏氟乙烯(PVDF)膜按照相應(yīng)順序放置轉(zhuǎn)膜夾內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(270 mA，70 min)。使用5%脫脂牛奶封閉1 h；將PVDF按條帶大小裁剪后放入對應(yīng)一抗內(nèi)4 ℃過夜，TBST潤洗3次，每次10 min；放置對應(yīng)種屬二抗室溫孵育1 h后TBST潤洗3次，每次10 min后顯影。

2 結(jié) 果

2.1姜黃素抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖 通過觀察姜黃素對U251細(xì)胞增殖的影響，在刺激時間相同的條件下，隨著姜黃素刺激濃度升高，U251細(xì)胞增殖活性下調(diào)；在姜黃素刺激濃度相同的條件下，作用時間越長，U251細(xì)胞增殖活性越下降明顯，見圖1。本研究認(rèn)為10 μmol/L姜黃素刺激24 h為理想實(shí)驗(yàn)刺激條件。

2.2姜黃素抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移 不同濃度的姜黃素刺激后，對U251細(xì)胞遷移能力均有明顯的抑制作用。與對照組比較，給藥組的U251細(xì)胞遷移能力呈下降趨勢，其中10 μmol/L姜黃素刺激下，細(xì)胞遷移能力降低至76.54%；20 μmol/L姜黃素刺激下，細(xì)胞遷移能力降至37.61%，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組細(xì)胞劃痕圖像，見圖2。

2.3姜黃素減弱神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞黏附 與對照組比較，在姜黃素刺激下，U251細(xì)胞黏附能力減弱，見圖3AB。姜黃素組黏附的數(shù)量為(207.97±15.68)個，明顯低于對照組的(299.12±38.40)個；姜黃素組膠質(zhì)瘤細(xì)胞黏附能力下降至68.60%，見圖3。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較

圖1姜黃素對U251細(xì)胞增殖的影響(n=3)

A ：初始劃痕圖像；B：對照組細(xì)胞遷移12 h后；C:姜黃素10 μmol/L組細(xì)胞遷移12 h后；D:姜素素20 μmol/L組細(xì)胞遷移12 h后

圖2各組細(xì)胞劃痕圖像(×100)

A ：對照組;B:姜黃素組；C：兩組細(xì)胞黏附能力比較；a：P<0.05，與對照組比較

圖3對照組與姜黃素組神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)晶紫染色(×100)及細(xì)胞黏附能力比較(n=3)

A:對照組；B:姜黃素10 μmol/L組；C：姜黃素20 μmol/L組；D:各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力比較；a：P<0.01，與對照組比較

圖4各組神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)晶紫染色(×100)及細(xì)胞侵襲能力比較 (n=3)

圖5 各組細(xì)胞熒光顯微鏡下Annexin V-FITC/PI 雙染結(jié)果(×100)

1：對照組；2：姜黃素組；3：Akt抑制劑組；4：姜黃素+Akt抑制劑組；a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較

圖6各組U251細(xì)胞中PTEN、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)水平比較(n=3)

2.4姜黃素下調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力 在不同濃度姜黃素刺激后，U251細(xì)胞侵襲能力呈下調(diào)趨勢，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10 μmol/L姜黃素組侵襲轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)量為(110.43±15.08)個，明顯低于對照組的(165.13±20.07)個；當(dāng)姜黃素濃度達(dá)到20 μmol/L時，侵襲轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)量為(65.57±5.36)個，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力明顯下調(diào)至41.00%，見圖4。

2.5姜黃素促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡 隨著姜黃素濃度升高，Annexin V-FITC染色陽性細(xì)胞及PI染色陽性細(xì)胞均逐漸增加，提示膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和死亡數(shù)量增多。與對照組(4.29%)比較，姜黃素10、20 μmol/L組U251細(xì)胞凋亡率(18.99%、32.17%)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各組細(xì)胞熒光顯微鏡下Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)果，見圖5。

2.6姜黃素對膠質(zhì)瘤細(xì)胞Akt和PTEN蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，姜黃素組U251細(xì)胞Akt蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6A、B；與對照組相比，姜黃素組U251細(xì)胞p-Akt/Akt表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖6A、C。給予Akt抑制劑(Quercetin)刺激作用后，與對照組比較，U251細(xì)胞Akt、p-Akt/Akt明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖6A、B、C。在姜黃素與Quercetin共同刺激下，與對照組比較，U251細(xì)胞Akt、p-Akt/Akt表達(dá)呈明顯下調(diào)趨勢(P<0.05)，見圖6A、B、C。在姜黃素處理的U251細(xì)胞，與對照組比較， PTEN蛋白表達(dá)明顯提高(P<0.01)，見圖6D。

3 討 論

腫瘤細(xì)胞遷移是腫瘤侵襲性的重要表現(xiàn)之一，腫瘤細(xì)胞的黏附能力是腫瘤轉(zhuǎn)移重要的生物學(xué)特征，腫瘤細(xì)胞的侵襲性是良惡性腫瘤的重要標(biāo)志。本研究探討姜黃素對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251作用研究，發(fā)現(xiàn)姜黃素對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等方面有明顯性抑制作用，并檢測到p-Akt、PTEN蛋白水平表達(dá)變化，揭示姜黃素通過這些相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)作用機(jī)制影響GBM的生物學(xué)行為，膠質(zhì)瘤作為顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，病死率極高，其治療顯得特別重要。目前基本治療手段是手術(shù)加放療，由于腫瘤浸潤性生長方式、放射性損傷周圍正常腦組織的特點(diǎn)，導(dǎo)致治療效果差。 自從2005年美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)了口服烷基化劑替莫唑胺(TMZ)治療GBM以來，TMZ被認(rèn)為是GBM的一線化療劑[9]，其分子機(jī)制是TMZ誘導(dǎo)DNA烷基化、形成交聯(lián)，觸發(fā)細(xì)胞凋亡。TMZ治療缺點(diǎn)是在腦腫瘤內(nèi)會產(chǎn)生耐藥性[10]。FDA批準(zhǔn)的另一種治療GBM藥物是貝伐單抗，是人源化的抗VEGF-A單克隆抗體。VEGF促進(jìn)血管生成，可上調(diào)VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[11]。貝伐單抗通過抑制膠質(zhì)瘤血管生成、下調(diào)VEGF信號通路起到治療作用。有研究發(fā)現(xiàn)貝伐單抗與靜脈血栓栓塞、出血和胃腸穿孔等不良反應(yīng)有關(guān)[12]。大多數(shù)抗GBM治療藥物涉及單一靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)[13]，開發(fā)新的多靶點(diǎn)、更安全的抗GBM藥物具有重要意義。

中藥成分姜黃素來源廣泛，在中國傳統(tǒng)食物如生姜等食物含量成分很大。二酮類化合物姜黃素具有抗炎、抗氧化、降脂等作用，廣泛應(yīng)用于慢性疾病治療。臨床研究表明，姜黃素單獨(dú)或與其他藥物合用，對癌癥患者具有良好的抗癌效果：姜黃素和紫杉醇協(xié)同作用可以抑制乳腺癌細(xì)胞的生長[14]；姜黃素能增強(qiáng)順鉑、依托泊苷和喜樹堿對癌細(xì)胞的損傷作用[15-16]。說明姜黃素對不同類型腫瘤細(xì)胞效應(yīng)作用存在一定的分子靶點(diǎn)。ZHANG等[17]報(bào)道姜黃素制劑能穿過小鼠的血腦屏障，這對姜黃素在治療顱內(nèi)疾病方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為姜黃素對膠質(zhì)瘤的治療提供了極大的可能性。

惡性腫瘤細(xì)胞屬性是無限的增殖與浸潤性生長，腫瘤細(xì)胞凋亡是影響腫瘤生長的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，具有抗腫瘤作用，證明了姜黃素除能對除實(shí)體瘤以外的腫瘤也具有抗腫瘤作用。本研究還表明姜黃素能明顯促進(jìn)GBM細(xì)胞凋亡的作用，也是對姜黃素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的解釋之一。

Akt/p-Akt是細(xì)胞增殖與信號調(diào)節(jié)通路的重要分子，Akt是信號傳導(dǎo)途徑中重要的蛋白激酶，p-Akt是Akt激活的主要機(jī)制，介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)。姜黃素通過聯(lián)合甘草次酸下調(diào)PI3K/Akt/PTEN信號通路的活化，從而抑制肝癌細(xì)胞生長[18]；姜黃素能通過Akt/PTEN/FOXO4通路誘導(dǎo)p53基因表達(dá)缺失的肝癌細(xì)胞株Hep3B凋亡[19]。這些研究表明，姜黃素可以通過Akt/PTEN通路有效的抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖。本研究中姜黃素對總Akt表達(dá)沒有明顯的影響，對p-Akt表達(dá)有明顯下調(diào)作用；發(fā)現(xiàn)姜黃素與Akt抑制劑(Quercetin)有明顯的協(xié)同效應(yīng)。本研究認(rèn)為姜黃素可通過p-Akt/Akt活性調(diào)節(jié)GBM增殖、侵襲與遷移。

PTEN是腫瘤組織中的抑癌基因，PTEN蛋白的沉默促進(jìn)腫瘤發(fā)生。PTEN蛋白是具有脂質(zhì)和蛋白磷酸酯酶活性的雙特異性磷酸酯酶，對腫瘤增殖、遷移有抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PTEN表達(dá)，對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的發(fā)揮抑制作用。LEE等[20]報(bào)道PI3K/Akt活性調(diào)節(jié)誘導(dǎo)PTEN泛素化促進(jìn)腫瘤形成，在本研究中姜黃素下調(diào)了p-Akt活性、抑制PTEN泛素化作用，上調(diào)PTEN表達(dá)從而抑制膠質(zhì)瘤的形成。因此本研究解釋了姜黃素通過下調(diào)Akt/PTEN通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。

姜黃素對GBM作用可能有更多的分子靶點(diǎn)參與其中，如姜黃素促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究；本研究中姜黃素對GBM作用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，需要在動物體內(nèi)的研究證明，是本課題進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。本研究重要意義是天然藥物姜黃素對GBM治療提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，可為能通過血腦屏障的抗GBM新藥研發(fā)工作提供資料。