宋 鑫，張 俊，魏立強，郭文淵，王仕祺，陳承魁△

(1.中國人民解放軍第九〇七醫(yī)院藥學(xué)科，福建南平 353000；2.福建醫(yī)科大學(xué)科技處，福州 350000；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科，西安 710032)

結(jié)腸癌具有早期侵襲及轉(zhuǎn)移的特點，其生物學(xué)惡性程度高，嚴(yán)重危害人類健康。結(jié)腸癌發(fā)病率呈年輕化態(tài)勢，近年來青年人結(jié)腸癌發(fā)病率較以往有了明顯的升高趨勢，提高早診率及結(jié)腸癌救治水平迫在眉睫[1]。現(xiàn)階段結(jié)腸癌治療仍主要依靠手術(shù)、放療及化療治療，外科手術(shù)技術(shù)的不斷提高及新的化療藥物的發(fā)展在很大程度上使得結(jié)腸癌的救治水平得到一定的改善，但仍有很多患者無法接受手術(shù)治療，化療藥物由于其較嚴(yán)重的毒副反應(yīng)使患者無法耐受，結(jié)腸癌病死率仍居高不下。中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥的發(fā)展彌補了這一缺陷[2-3]。黃芪味甘，性溫，有健脾理氣的功效，得益于其低毒副作用、高效及多靶點的優(yōu)勢，黃芪已廣泛應(yīng)用于結(jié)腸癌抑制腫瘤生長、減輕化療副反應(yīng)、放療增敏以及改善患者癥狀[4-7]。本研究基于黃芪治療結(jié)腸癌的基礎(chǔ)，研究黃芪多糖對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞生長作用的影響，探討黃芪多糖抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的作用機制，為黃芪治療結(jié)腸癌提供實驗和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞株系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。

1.1.2藥物及試劑 黃芪多糖購自森弗生物公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Amresco公司；MCCOY′S 5A培養(yǎng)基購自北京Macgene公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Amresco公司；胰蛋白酶購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；碘化丙啶(PI)周期檢測試劑盒購自美國BD公司；小鼠免疫組化染色S-P檢測試劑盒，濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3實驗儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國Heracus公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；離心機購自德國Eppendorf公司；紫外分光光度計購自美國Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司；超凈工作臺購自西安凈化儀器廠；移液器購自德國Eppendorf公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、黃芪多糖配制及實驗分組 細(xì)胞在37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MCCOY′S 5A培養(yǎng)液中，適時使用胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。超凈工作臺內(nèi)無菌條件下用MCCOY′S 5A培養(yǎng)液溶解黃芪多糖粉末呈不同濃度的黃芪多糖混合培養(yǎng)液，使黃芪多糖的終濃度分別為50、100、200 μg/mL，設(shè)置分組如下：對照組加入200 μL培養(yǎng)液，黃芪多糖A、B、C組分別加入含黃芪多糖50、100、200 μg/mL的黃芪多糖混合培養(yǎng)液200 μL。

1.2.2MTT法檢測細(xì)胞增殖 采用MTT法檢測 細(xì)胞增殖，選取對數(shù)生長期HT-29細(xì)胞，以2×104個/mL的濃度接種于96孔板中培養(yǎng)，每孔200 μL，共接種4塊板，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h待細(xì)胞完全貼壁后，按照倍比稀釋方法，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為終濃度為75、125、250、500、1 000 μg/mL的黃芪多糖混合培養(yǎng)液200 μL，對照組為不含黃芪多糖的培養(yǎng)液200 μL，根據(jù)濃度不同將實驗分為6組，每組樣本設(shè)置5個副孔，其中1個副孔為只加培養(yǎng)液不含細(xì)胞的空白對照用以排除試劑對實驗結(jié)果的影響，分別在培養(yǎng)0、24、48、72 h各取出1塊96孔板每孔加入MTT液 25 μL(5 mg/mL)，將該96孔板繼續(xù)孵育4 h后每孔加入DMSO液200 μL，酶標(biāo)儀上在490 nm波長下檢測各組樣本吸光度值，分別記錄4塊板上各組細(xì)胞的吸光度值，根據(jù)吸光度值繪制生長增殖曲線。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，選取對數(shù)生長期HT-29細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞分組情況對各組細(xì)胞進(jìn)行處理，收取各組細(xì)胞樣本，磷酸鹽緩沖液(PBS)液漂洗后使用胰蛋白酶消化，加入PBS反復(fù)漂洗，輕輕吹打制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)濃度約為1×106個/mL，離心收取細(xì)胞沉淀后使用500 μL固定液固定，依此加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 10 μL，混勻后室溫條件下避光孵育10～15 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4細(xì)胞周期檢測 采用PI周期檢測試劑盒流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，細(xì)胞處理同凋亡檢測，在6孔板內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，對照組加入2 mL培養(yǎng)液；黃芪多糖組加入2 mL終濃度為100 μg/mL黃芪多糖混合培養(yǎng)液，48 h后收集細(xì)胞加入細(xì)胞周期檢測試劑盒溶液A 250 μL，充分混勻后室溫條件下孵育10 min，然后加入溶液B 200 μL，繼續(xù)室溫孵育10 min后加入預(yù)冷的C液200 μL，避光條件下冰浴10 min，流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié) 果

2.1黃芪多糖抑制HT-29細(xì)胞增殖

2.1.1黃芪多糖抑制HT-29細(xì)胞增殖的半數(shù)致死量(IC50) 檢測24 h黃芪多糖對HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用，MTT法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，黃芪多糖在75 μg/mL以上時，對HT-29細(xì)胞具有較明顯的抑制增殖作用，且當(dāng)其濃度大于200 μg/mL時，24 h細(xì)胞存活率低于25%，由Graphpad軟件求得其IC50值為92.49 μg/mL(圖1)，其95%可信區(qū)間(CI)為78.32～109.20 μg/mL，故選擇黃芪多糖50、100、200 μg/mL為實驗分組濃度。

2.1.2不同濃度黃芪多糖對HT-29細(xì)胞增殖能力的影響 對照組及黃芪多糖A、B、C組分別在培養(yǎng)第0、24、48、72 h時應(yīng)用MTT法檢測黃芪多糖對HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果顯示黃芪多糖可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的增殖，且當(dāng)濃度小于200 μg/mL時，隨著黃芪多糖濃度的增高其抑制增殖作用增強，抑制作用呈劑量依賴型，見圖2。

圖1 黃芪多糖抑制HT-29細(xì)胞增殖的IC50

a:P<0.05；b：P<0.01,與對照組比較

圖2各組HT-29細(xì)胞增殖能力比較

2.2黃芪多糖促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡 在培養(yǎng)第48 h時Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率，與對照組比較，黃芪多糖A組僅晚期凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而黃芪多糖B、C組早期凋亡率及晚期凋亡率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且晚期凋亡率均明顯增高(P<0.01)，見表1。

表1 黃芪多糖對HT-29細(xì)胞凋亡的影響

a：P<0.05,b:P<0.01，與對照組比較

2.3黃芪多糖對HT-29細(xì)胞具有細(xì)胞周期阻滯作用 培養(yǎng)48 h，與對照組比較，黃芪多糖組HT-29細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞數(shù)目增加(P=0.0186)，S期細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P=0.0087)，G2/M期細(xì)胞數(shù)目無明顯變化(P>0.05)，見表2。

表2 兩組HT-29細(xì)胞周期細(xì)胞數(shù)量比較

a：P<0.05，與對照組比較

3 討 論

現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為大腸癌發(fā)生主要由外感六淫、飲食不節(jié)、情志失調(diào)所導(dǎo)致的正氣虧虛、氣血失調(diào)、毒邪蘊結(jié)大腸而導(dǎo)致，晚期大腸癌常表現(xiàn)為脾腎虧虛、氣血不足，術(shù)后氣血兩虛，化療使患者脾氣不足是大腸癌患者癥狀難以改善的根本[8]。研究證實，內(nèi)服中藥對大腸癌臨床癥狀的緩解及化療毒副作用的減輕有明確療效，臨床治療大腸癌常用枳實消痞丸、參苓白術(shù)湯等經(jīng)方，亦使用康艾注射液、康萊特注射液等中成藥注射液，扶正的同時兼顧攻邪，健脾益氣，在這方面取得了確切的治療效果[9]。中醫(yī)外治法作為內(nèi)服中藥的補充可通過局部給藥直達(dá)病灶局部，達(dá)到緩解大腸癌患者便秘、便血、腸脹氣等并發(fā)癥的目的，同時可以縮小腫瘤大小達(dá)到治療效果。中藥灌腸、針灸療法、穴位注射、中藥外涂、中藥坐浴、熱奄包、封包等在臨床上廣泛用于大腸癌的中醫(yī)外治[9]。

黃芪性喜涼爽，耐寒耐旱，產(chǎn)于內(nèi)蒙古、山西、甘肅、黑龍江等地，屬補氣良藥，以補虛為主，可有效增強機體免疫功能，有保肝利尿、抗衰老、抗應(yīng)激、降壓以及廣譜抗菌功效[10]，黃芪多糖是黃芪的主要生物學(xué)活性成分，其組成為多糖和黃芪苷，黃芪苷分為黃芪苷Ⅰ、黃芪苷Ⅱ、黃芪苷Ⅳ，其中生物活性最好的是黃芪苷Ⅳ即黃芪甲苷，黃芪甲苷能增強機體免疫力、提高機體的抗病能力及抗腫瘤功效，有研究證實，黃芪甲苷對結(jié)腸癌[11-12]、乳腺癌[13]、胃癌[14]、宮頸癌[15]、肝癌[16]、胰腺癌[17]等癌癥都有治療作用。黃芪可以通過影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，阻滯細(xì)胞增殖周期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[18]；黃芪還可以影響細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[19]；黃芪亦可通過調(diào)控癌基因及抑癌基因表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移起到抗腫瘤目的；其抗氧化應(yīng)激功效可有效清除和抑制自由基，逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥及輔助化療藥物抗腫瘤治療等。

王倩竹等[20]通過90例結(jié)直腸癌患者治療研究比較認(rèn)為中藥對方(黃芪、角針)對結(jié)直腸癌患者術(shù)后腸道屏障功能損害有一定的保護(hù)作用，在腸功能恢復(fù)、減輕毒素吸收和降低致炎因子水平方面可能優(yōu)于西藥；閻力君等[2]通過體外實驗的方法得出結(jié)論認(rèn)為黃芪多糖對結(jié)腸癌細(xì)胞SW620 具有明顯的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，其誘導(dǎo)凋亡機制可能是通過線粒體凋亡通路實現(xiàn)；有研究證實黃芪甲苷在結(jié)腸癌的治療中能夠通過抑制自噬增強西妥昔單抗(CTX)的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用。

本研究應(yīng)用藥物不同濃度梯度抑制HT-29細(xì)胞增殖，計算出黃芪多糖抑制HT-29細(xì)胞增殖的IC50，而后根據(jù)IC50值設(shè)置不同的黃芪多糖濃度作為實驗分組，通過MTT實驗，檢測不同濃度黃芪多糖對HT-29細(xì)胞增殖能力的影響；利用流式細(xì)胞儀分別檢測不同濃度黃芪多糖對HT-29細(xì)胞凋亡及周期的影響。結(jié)果表明：黃芪多糖抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的增殖，當(dāng)濃度小于200 μg/mL時，隨著黃芪多糖濃度的增高其抑制增殖作用增強，抑制作用呈劑量依賴型；黃芪多糖可以促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡，黃芪多糖使HT-29細(xì)胞的生長停滯在G1期,說明黃芪多糖對HT-29細(xì)胞具有周期阻滯作用，其主要為G1期阻滯。

本研究通過計算黃芪多糖作用于HT-29細(xì)胞的IC50,在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞系中證實了黃芪的抗腫瘤作用，研究結(jié)果認(rèn)為，黃芪治療結(jié)腸癌的抗腫瘤機制是黃芪多糖可使結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞阻滯于G1期。本研究為黃芪多糖用于結(jié)腸癌治療可提供新的理論依據(jù)，并為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。