吳春華，王貝然，余義俊，周 舟，杜 偉

(大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院/大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院放射科，云南大理 671000)

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是世界最常見的惡性腫瘤之一，致死率僅次于肺癌[1]。經(jīng)導(dǎo)管肝動脈栓塞術(shù)(transcatheter arterial embolization，TAE)是治療PHC的主要方法[2-4]，可抑制局部腫瘤的生長，但TAE術(shù)后患者出現(xiàn)不同程度肝功能下降，是其不可避免的并發(fā)癥[5-6]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPARs)是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族成員[7]。PPAR-α激動劑WY14643對包括肝臟在內(nèi)的重要臟器的保護(hù)作用可能與PPARα激動劑具有抗氧化作用相關(guān)。本研究建立兔VX2肝癌TAE模型，通過觀察PPAR-α激動劑WY14643對肝癌TAE術(shù)后癌旁肝組織氧化應(yīng)激損傷的作用情況，旨在分析WY14643在肝癌 TAE術(shù)后對肝功能的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗動物 荷瘤兔2只(由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院惠贈)，健康新西蘭大白兔30只[由昆明楚商科技有限公司提供，許可證號SCXK(滇)K2018-0001]，體質(zhì)量2.5～3.5 kg，雌雄不限，普通飼料喂養(yǎng)。

1.1.2主要使用設(shè)備、實(shí)驗器材及藥品 PHILIPS 16排螺旋CT機(jī)，TOSHIBA TAITAN 3.0T磁共振機(jī)，GE INNOVA-3100IQ DSA，自制實(shí)驗兔手術(shù)臺，自制小洞巾，各型號注射器，3%戊巴比妥鈉，硫酸慶大霉素注射液,0.9%NaCl,超液態(tài)碘化油，明膠海綿顆粒350～560 μm(杭州艾力康醫(yī)藥科技有限公司提供),碘海醇，眼科剪，眼科鑷，培養(yǎng)皿，超凈臺，動脈夾，18G穿刺針，4F導(dǎo)管鞘，3FSP微導(dǎo)管。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、過氧化氫酶 (catalase,CAT)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)試劑盒均購自南京建成生物試劑有限公司；WY14643(批號MKCF1249)購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1荷瘤兔傳代及VX2肝癌模型建立 隨機(jī)選取荷瘤種兔1只，2%戊巴比妥鈉(3 mg/kg)靜脈麻醉并固定，于后肢腫瘤處常規(guī)備皮、消毒，切入表皮，剝離腫塊,并將其周圍壞死組織剔除干凈，將瘤塊邊緣生長旺盛的魚肉樣腫瘤組織置于50 mL 0.9%NaCl和2萬U慶大霉素混合液的培養(yǎng)皿中，用眼科剪將瘤塊剪成1～3 mm的碎塊。用1 mL注射器抽吸瘤?；旌弦?15～20個瘤粒/mL)后套用18G穿刺針?biāo)椭两】低煤笸绕は?，以保種傳代。將兔麻醉固定后，備皮、消毒并鋪巾，劍突下正中偏左側(cè)縱向切開腹部，暴露肝左葉，用眼科鑷將肝左葉完整拉出，1 mL注射器換用18 G穿刺針呈30°斜穿刺入肝左葉1.5～2.0 cm，回抽未見血液及膽汁回流后注入瘤?；旌弦? mL并迅速用明膠海綿填塞穿刺通道,防止瘤粒脫出，確保種植成功，腹腔內(nèi)灑入慶大霉素40萬U，局部紗布壓迫止血3 min，檢查無滲血后回納肝臟，逐層縫合腹部切口，術(shù)后連續(xù)3 d肌內(nèi)注射慶大霉素8萬U預(yù)防感染。

1.2.2實(shí)驗?zāi)Ｐ头纸M及處理 于接種后2周分別行CT及MRI掃描，確定肝癌瘤體在肝內(nèi)的生長情況(圖1～2)，將建模成功的24只VX2肝癌兔進(jìn)行隨機(jī)分組，其中對照組8只，TAE組8只，聯(lián)合治療組8只，TAE組只行TAE手術(shù)；聯(lián)合治療組注射WY14643 3 mg·kg-1·d-1，連續(xù)給藥3 d后行TAE術(shù)，對照組不做任何處理。

1.2.3TAE VX2肝癌模型兔全麻后固定于操作臺上，右腹股溝附近10 cm范圍內(nèi)備皮、消毒后皮膚切一小口，用18G穿刺針穿刺進(jìn)入股動脈后引入導(dǎo)絲，拔去穿刺針后引入4F導(dǎo)管鞘，經(jīng)導(dǎo)管鞘放入4F導(dǎo)管，通過導(dǎo)絲選入腹腔干，然后將3F微導(dǎo)管通過4F導(dǎo)管超選入肝總動脈，造影明確腫瘤供血動脈，然后行超選擇性肝動脈造影，經(jīng)3F微導(dǎo)管推入碘化油，劑量為每只荷瘤兔腫瘤直徑厘米數(shù)×0.2 mL，并依據(jù)腫瘤供血情況適當(dāng)增減[8]，最后用明膠海綿顆粒栓塞，直至供血動脈血流緩慢停止(圖3)，術(shù)畢拔管并結(jié)扎肝動脈近端，處理切口。

A:平掃顯示肝實(shí)質(zhì)內(nèi)不均勻低密度病灶，腫瘤中心密度較低(紅箭)；B:增強(qiáng)顯示腫瘤實(shí)質(zhì)及邊緣呈不均勻明顯強(qiáng)化，中心壞死區(qū)不強(qiáng)化(紅箭)

圖1肝臟CT掃描的影像表現(xiàn)

A：MRI T1WI軸位掃描顯示肝內(nèi)不規(guī)則低信號改變(紅箭)；B:MRI T2WI軸位掃描顯示肝內(nèi)不規(guī)則稍高信號改變(紅箭);C:MRI T2WI失狀位掃描

圖2肝臟MRI掃描的影像表現(xiàn)

A:腹腔干造影腫瘤血管推移呈“抱球征”；B:超選擇性插管推注碘油；C:TAE術(shù)后復(fù)查造影顯示腫瘤供血動脈血流中斷，血管閉塞；D:TAE術(shù)后平片見腫瘤區(qū)有碘油沉積

圖3腹腔干及肝動脈血管造影的影像表現(xiàn)

1.2.4實(shí)驗室檢查指標(biāo)對肝功能的評價 分組處理后3 d，對3組實(shí)驗兔分別抽血檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBI)、血清清蛋白(ALB)、凝血酶原時間(PT)，具體操作步驟按照說明書進(jìn)行。

1.2.5肝組織SOD、GSH-PX、CAT和MPO的水平測定 3 d后將實(shí)驗動物處死，位于左上腹劍突下腹正中切口切取完整肝臟，分離瘤組織與周圍正常肝組織，距腫瘤大于2 cm處選取癌旁正常肝組織[8]，用生物酶學(xué)方法進(jìn)行檢測，具體操作步驟按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1肝癌模型建立成功率 成功建立兔肝癌模型24只，造模成功率為80.00%(24/30)。

2.2實(shí)驗室檢查肝功能各指標(biāo)水平 術(shù)后3 d各組復(fù)查肝功能，TAE組肝功能明顯下降，與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義比較(P<0.05)，聯(lián)合治療組與TAE組比較，ALT、AST、TBI降低，ALB升高，PT縮短，肝功能好轉(zhuǎn)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合治療組與對照組相關(guān)指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.3各組動物癌旁肝組織中SOD、GSH-PX、CAT和MPO水平比較 3組各指標(biāo)用方差分析進(jìn)行比較：與對照組比較，TAE組SOD、GSH-PX、CAT和MPO水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與TAE組比較，聯(lián)合治療組SOD、GSH-PX、CAT和MPO活力明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合治療組與對照組相關(guān)指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 各組動物肝功能相關(guān)指標(biāo)比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與TAE組比較

表2 各組動物癌旁肝組織SOD、GSH-PX、CAT和MPO水平比較

a：P<0.05,與對照組比較；b：P<0.05，與TAE組比較

3 討 論

近些年，PHC發(fā)病率逐年上升，大多數(shù)患者在確診時已經(jīng)失去手術(shù)切除或肝移植的時機(jī)，僅有10%～20%有手術(shù)切除或肝移植的機(jī)會[9]。TAE可提供較好的局部區(qū)域腫瘤治療并延長患者的生存率，但即便用超選進(jìn)行栓塞治療，栓塞劑不可避免地進(jìn)入癌旁正常肝組織并沉積于微小動脈和毛細(xì)血管，導(dǎo)致組織缺血缺氧，最終不可避免地造成TAE術(shù)后肝功能下降[10-11]，影響患者的預(yù)后。

自由基過多會在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起組織損傷，SOD、GSH-PX、CAT是生物體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的天然自由基清除系統(tǒng)[12]，均屬于酶促抗氧化系統(tǒng)，其中SOD是最為關(guān)鍵的酶之一[13]，當(dāng)肝臟缺血被阻斷再重新恢復(fù)血流供應(yīng)后，會有大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生,它具有較活躍的化學(xué)性質(zhì)，極易與肝細(xì)胞膜上的重要功能與結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生過氧化反應(yīng)，引發(fā)一系列復(fù)雜的內(nèi)源性反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[14]。另外，MPO是血紅素輔基的血紅素蛋白酶，是血紅素過氧化物酶超家族成員之一，其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細(xì)胞的功能和活性狀態(tài)，主要存在于中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒中，因此MPO活性可作為中性粒細(xì)胞的標(biāo)記物，定量反應(yīng)白細(xì)胞浸潤的數(shù)量，也是作為炎癥調(diào)節(jié)的基本成分，其活性的變化可對早期組織損傷做出較敏感的反應(yīng)。PPAR-α主要在人體重要臟器特別是肝細(xì)胞中表達(dá)，通過調(diào)控相關(guān)基因，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎癥因子產(chǎn)生和釋放，減輕或阻止肝組織損傷[15-19]。本課題組前期研究表明，TAE后癌旁肝組織的炎癥因子如TNF-α、IL-10水平升高，同時，抗氧化酶活力明顯下降，MPO水平下降，引起氧自由基釋放增多，在肝組織中炎性細(xì)胞聚集、浸潤，凋亡細(xì)胞增多，導(dǎo)致肝組織損傷，肝功能下降[20-22]。

本研究結(jié)果顯示，肝癌TAE術(shù)后肝功能下降，經(jīng)過PPAR-α激動劑WY14643預(yù)處理之后，肝功能損傷減輕，與對照組比較，TAE組癌旁肝組織中SOD、GSH-PX、CAT和MPO水平降低，而給予WY14643 處理治療后癌旁肝組織中上述指標(biāo)水平明顯升高，說明WY14643可通過降低癌旁肝組織的氧化應(yīng)激作用而減輕肝組織損傷。

綜上所述，WY14643可減輕肝癌TAE術(shù)后，肝細(xì)胞缺血缺氧，癌旁組織發(fā)生氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷，機(jī)制可能是WY14643促進(jìn)SOD、CAT、GSH-PX、MPO等抗氧化酶活性的表達(dá)，抑制癌旁肝組織氧化應(yīng)激的發(fā)生。本實(shí)驗從動物水平研究PPAR-α激動劑WY14643在肝組織損傷中的治療作用，有利于尋找新的、安全有效的保護(hù)肝功能、減輕肝損傷的方法，對于改善肝臟 TAE 術(shù)后患者的生存率，具有非常重要的理論與臨床實(shí)踐的指導(dǎo)意義。