王學(xué)惠，李慧丹，朱秀英，劉慧兵，張永春△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院：1.心血管內(nèi)科；2.急診科，河南衛(wèi)輝 453100)

急性一氧化碳中毒(acute carbon monoxide poisoning，ACOP)是我國(guó)北方冬季最常見的急性中毒性疾病，也是病死率最高的職業(yè)中毒[1-2]。在許多國(guó)家是家庭事故和自殺的主要原因，主要是由于對(duì)心臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害[3-5]。國(guó)內(nèi)外屢見報(bào)道ACOP引起的神經(jīng)系統(tǒng)損害，而對(duì)心臟損害關(guān)注不夠。ACOP引起心肌損傷表現(xiàn)為心律失常、心力衰竭等，早期表現(xiàn)以心律失常為主，其確切發(fā)病機(jī)制不清。而關(guān)于ACOP條件下心肌縫隙連接的改變，國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。本研究采用大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)用腹腔內(nèi)注射純一氧化碳?xì)怏w，制備ACOP動(dòng)物模型，觀察心肌縫隙連接的改變，擬探討ACOP導(dǎo)致心肌損害的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 動(dòng)物：健康雄性青年Wistar大鼠40只，3～5月齡，體質(zhì)量(300±25)g，購(gòu)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。試劑：小鼠縫隙連接蛋白(connexin，Cx)43多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Zymed，山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中山生物公司。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒，兩步免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 將40只健康雄性青年Wistar大鼠分為ACOP組和對(duì)照組，每組20只。

1.2.2一氧化碳?xì)怏w的制備 制備一氧化碳?xì)怏w采用甲酸加濃硫酸，濃硫酸用作脫水劑，可得純凈的一氧化碳?xì)怏w，將一氧化碳?xì)怏w收集在負(fù)壓引流袋中備用，于應(yīng)用前新鮮制備。

1.2.3ACOP動(dòng)物模型的建立 參照PENNEY[6]報(bào)道方法并改進(jìn)。ACOP組大鼠腹腔內(nèi)注射一氧化碳?xì)怏w170 mL/kg， 對(duì)照組大鼠腹腔內(nèi)注射空氣 170 mL/kg。

1.2.4大鼠心電圖的描記 腹腔注射2 h后，通過腹膜內(nèi)注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉動(dòng)物。將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，用普通的單通道心電圖機(jī)，將輸出肢體導(dǎo)線的4個(gè)電極轉(zhuǎn)換成鱷魚夾。走紙速度為25 mm/s，電壓為10 mv/mm。選擇抗干擾，記錄Ⅱ?qū)?lián)30 s。

1.2.5測(cè)定尾血碳氧血紅蛋白(HbCO)水平 中毒后2 h，通過尾切法采集大鼠的尾血，并通過改進(jìn)的Rodkey FL微量定量法測(cè)量血液HbCO水平。

1.2.6ACOP評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 觀察大鼠反應(yīng)和檢測(cè)尾血HbCO的水平來確定中毒程度。重度ACOP大鼠表現(xiàn)為精神萎靡，四肢癱軟，運(yùn)動(dòng)少，呼吸急促，有便溺。

1.2.7心肌組織Cx43 IHC染色 取左心室心肌組織，脫水后冰凍切片，厚度7 μm。采用IHC染色方法，操作步驟如下：玻片復(fù)溫后磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3 min，0.3% Triton-100室溫孵育10 min， PBS漂洗3次×3 min，再0.3%過氧化氫室溫孵育10 min， PBS漂洗3次×3 min，用5%驢血清室溫封閉1 h，滴加1∶100稀釋的 Cx43多克隆抗體，4 ℃孵育過夜， PBS漂洗3次×min，滴加二抗，室溫孵育30 min， PBS漂洗3次×3 min，應(yīng)用 DAB溶液顯色，用蒸餾水沖洗，用蘇木精復(fù)染，用乙醇梯度脫水，用二甲苯透明，并用中性膠封片。以抗體稀釋液代替一抗作為陰性對(duì)照。陽性結(jié)果判斷：Cx43表達(dá)陽性是深棕色顆粒，蘇木精復(fù)染的細(xì)胞核是淡藍(lán)色的。

1.2.8左心室心肌組織Cx43定量檢測(cè) 取約30 mg的心肌組織置于研缽內(nèi)，用液氮研磨，并加入裂解液，離心后取上清液，應(yīng)用二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液后，每孔上樣蛋白50 μg，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)分離后，采用Western blot將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至氯二氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h， 然后分別加入抗 Cx43和 GAPDH的抗體，4 ℃搖床孵育過夜。用 TBST漂洗3次×10 min，洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h，用 TBST漂洗3次×10 min，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，凝膠成像儀掃描拍照，用 Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析， 以 Cx43與 GAPDH條帶的比值來評(píng)定 Cx43表達(dá)水平。

1.2.9透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu) 麻醉后立即開胸取出心臟，將左心室心肌組織切成1 mm3的大小塊狀，快速置于4%戊二醛溶液中固定，固定24 h后，將標(biāo)本送至西安交通大學(xué)電鏡實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行檢測(cè)。先將組織塊沖洗，應(yīng)用1%鋨酸固定1 h，再梯度丙酮脫水，應(yīng)用環(huán)氧樹脂浸透，然后包埋，聚合，切片，片厚約50 nm。應(yīng)用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，日立 H-7650型透射電子顯微鏡下觀察心肌組織的超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠血液HbCO水平比較 ACOP組大鼠中毒后，5～10 min出現(xiàn)煩躁、撞籠，15～25 min出現(xiàn)活動(dòng)減少、抽搐和昏迷。嘴唇的黏膜、肢端的皮膚顏色轉(zhuǎn)為櫻桃紅色，部分大鼠出現(xiàn)角弓反張。 對(duì)照組大鼠無上述表現(xiàn)。 2 h后采大鼠尾血檢測(cè)HbCO水平，ACOP組為(65.13±4.02)%，對(duì)照組為(5.22±0.89)%， 兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2兩組大鼠心電圖比較 ACOP組大鼠出現(xiàn)心率減慢，竇性心動(dòng)過緩、心房纖顫及S-T段壓低或抬高的改變。心電圖異?？偘l(fā)生率為80.00%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.3兩組大鼠心肌組織Cx43 IHC染色比較 對(duì)照組光鏡下觀察，Cx43表達(dá)陽性的棕色顆粒，呈高度規(guī)律性排列、分布密集。在心肌纖維縱切面，棕色顆粒呈簇狀，多數(shù)分布在垂直于心肌細(xì)胞長(zhǎng)軸的端-端連接處，而少數(shù)分布于與長(zhǎng)軸平行的側(cè)-側(cè)連接處。ACOP組光鏡下觀察，Cx43表達(dá)陽性的棕色顆粒，呈無序、紊亂分布，端-端處棕色顆粒分布減少，側(cè)-側(cè)處及細(xì)胞表面分布增加，見圖2。

a:P<0.05，與對(duì)照組比較

圖1兩組大鼠心電圖相關(guān)指標(biāo)比較

A:對(duì)照組;B:ACOP組

圖2大鼠心肌組織Cx43 IHC染色(×400)

2.4兩組大鼠左心室心肌組織Cx43水平比較 ACOP組與對(duì)照組大鼠總Cx43(T-Cx43)表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而ACOP組大鼠磷酸化Cx43(P-Cx43)表達(dá)明顯降低(P<0.05)，且P-Cx43/T-Cx43兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.9039vs.0.4905，P<0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與對(duì)照組比較

圖3兩組大鼠左心室心肌組織Cx43水平比較

2.5兩組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)比較 電子顯微鏡觀察顯示，對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞肌絲排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，肌節(jié)規(guī)則，線粒體水平豐富，脊呈板層狀橫向排列且致密；閏盤結(jié)構(gòu)清晰，糖原水平豐富。ACOP組大鼠肌原纖維水腫，排列紊亂，電子密度降低，部分肌原纖維溶解，部分肌節(jié)斷裂；線粒體腫脹，基質(zhì)密度淡，線粒體脊排列紊亂；閏盤結(jié)構(gòu)模糊，部分閏盤融合消失，見圖4。

A:對(duì)照組;B:ACOP組

圖4兩組大鼠左心室心肌組織的超微結(jié)構(gòu)(×20 000)

3 討 論

一氧化碳中毒對(duì)機(jī)體的損害主要是缺氧。一氧化碳中毒可引起心肌缺氧，加上一氧化碳對(duì)心肌細(xì)胞的直接毒性作用，更容易引起心肌損傷[7]。ACOP引起心肌缺血或梗死的機(jī)制有[8]：(1)由于一氧化碳和Hb結(jié)合形成HbCO，血液的攜氧能力降低，O2-Hb解離曲線向左移，使氧氣不能釋放到組織，導(dǎo)致組織缺氧；(2)一氧化碳和肌紅蛋白結(jié)合使心肌線粒體受損，它與線粒體中的細(xì)胞色素氧化酶相結(jié)合，可抑制細(xì)胞呼吸鏈，可以引起細(xì)胞呼吸抑制，造成組織進(jìn)一步缺氧，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，血液循環(huán)發(fā)生障礙，血栓形成，可阻斷冠狀動(dòng)脈血管，導(dǎo)致心肌梗死。ACOP引起各種心律失常的機(jī)制[8]：當(dāng)ACOP引起心肌細(xì)胞急性缺氧時(shí)，會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺乏能量，局部酸性代謝產(chǎn)物增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜的離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能受損，細(xì)胞內(nèi)鉀丟失，而鈉潴留。特殊傳導(dǎo)系統(tǒng)的潛在起搏膜電位降低，去激化速度減慢，自律性增高，而傳導(dǎo)性降低。引起電興奮傳導(dǎo)產(chǎn)生單向阻滯、折返，也可產(chǎn)生異位節(jié)律，發(fā)生各種心律失常。

ACOP后出現(xiàn)心肌損傷，臨床特征以心電圖異常為主，ACOP后心電圖無特異性改變。常見心電圖異常為T波低平、倒置、S-T段壓低或抬高、Q-T間期延長(zhǎng)，可出現(xiàn)早搏、心房顫動(dòng)、房室和室內(nèi)傳導(dǎo)阻滯、低電壓等[9-10]。本研究在ACOP組大鼠的心電圖中觀察到心肌受損和多種心律失常，與文獻(xiàn)一致。

縫隙連接主要存在于閏盤處，是心肌細(xì)胞間連接的主要方式?？p隙連接使心臟成為功能上的整體，使各部位協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)。在成年心臟，縫隙連接主要位于細(xì)胞兩端閏盤處，由連接蛋白組成的兩個(gè)連接子對(duì)接而成，而連接子又由6個(gè)亞單位-連接蛋白組成[11]。多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展與縫隙連接通道功能的受損有關(guān)，也與Cx表達(dá)改變有關(guān)，尤其在心律失常發(fā)生中的作用[12]。哺乳類動(dòng)物心室肌主要表達(dá)連接蛋白是Cx43，Cx43屬于磷蛋白，P-Cx43對(duì)縫隙連接通道功能有非常重要的影響[13]。

縫隙連接的分布和功能狀態(tài)與心肌細(xì)胞的傳導(dǎo)方向和速度密切相關(guān)。在心房肌，電興奮通過縫隙連接縱向傳導(dǎo)速度較橫向傳導(dǎo)速度快10～20倍，而在心室肌中傳導(dǎo)速度快3倍，與Cx主要分布在心肌細(xì)胞兩端特點(diǎn)相一致；利用Cx43基因的定標(biāo)突變技術(shù)發(fā)現(xiàn)，雜合子小鼠(Cx43-/+)比野生型小鼠(Cx43+/+)心室肌外膜的電傳導(dǎo)速度下降30%～40%，QRS波的復(fù)極時(shí)間明顯延長(zhǎng)；體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞，隨著細(xì)胞縫隙連接增加，細(xì)胞間的不規(guī)則收縮趨于同步；研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死、缺血/再灌注、心肌炎與心肌病等心肌中均出現(xiàn)與心律失常相關(guān)Cx43表達(dá)的降低與分布紊亂[14]。而UZZAMAN等[15]還發(fā)現(xiàn)，這種改變可伴隨縱向傳導(dǎo)速度下降30%。

李玉光等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Cx43在急性心肌缺血時(shí)迅速降解，端-端連接處的降解比側(cè)-側(cè)連接處明顯，中層心肌細(xì)胞間的Cx43比心內(nèi)膜和心外膜更易降解。Cx43在端-端處分布減少引起心肌細(xì)胞縱向傳導(dǎo)的速度明顯下降，傳導(dǎo)各向異性發(fā)生明顯改變。這些改變會(huì)引起細(xì)胞間傳導(dǎo)阻滯和折返，而導(dǎo)致發(fā)生心律失常。

本研究IHC染色結(jié)果顯示，ACOP組心肌Cx43表達(dá)的分布發(fā)生了明顯變化。細(xì)胞間端-端處Cx43減少，細(xì)胞側(cè)面及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布增加，且由縱軸向橫軸重新分布，分布散亂、無序。與急性缺血時(shí)心肌Cx43分布特點(diǎn)相同。急性缺血時(shí)心肌的Cx43表達(dá)下降，而本文ACOP組大鼠Cx43分布密度不均勻，有些部位稀疏，有些部位密集，可能與ACOP后血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生腫脹，血循環(huán)發(fā)生障礙，形成血栓，阻塞冠狀動(dòng)脈血管，引起心肌梗死，使Cx43在局部心肌降解有關(guān)。Cx43表達(dá)密度不均，提示Cx43在心肌細(xì)胞中各部位分布不均一，會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞間電偶聯(lián)不均一性增大，導(dǎo)致興奮傳導(dǎo)速度和擴(kuò)布路徑發(fā)生復(fù)雜的變化，會(huì)誘導(dǎo)各種心律失常。

研究報(bào)道，急性缺血性心肌組織中的P-Cx43水平下降而去磷酸化Cx43(NP-Cx43)水平升高，這使細(xì)胞間脫偶聯(lián)，導(dǎo)致傳導(dǎo)異常而出現(xiàn)心律失常[17]。YUNIS等[18]在研究擴(kuò)張型心肌病心律失常機(jī)制時(shí)認(rèn)為，P-Cx43水平、分布改變與疾病發(fā)生明顯相關(guān)。Cx43磷酸化也參與心肌缺血的病理過程。BEARDSLEE等[17]研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下心肌中的Cx43是磷酸化狀態(tài)。當(dāng)進(jìn)行缺血預(yù)處理時(shí)，Cx43出現(xiàn)去磷酸化，而NP-Cx43的比例隨著缺血時(shí)間的增加而增加。再灌注時(shí)，P-Cx43表達(dá)增加，心肌細(xì)胞功能逐漸恢復(fù)。因此，缺血誘導(dǎo)的解偶聯(lián)與Cx43的去磷酸化，縫隙連接內(nèi)的NP-Cx43的累積及Cx43從縫隙連接向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移相關(guān)。

本研究對(duì)T-Cx43和P-Cx43水平均進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ACOP時(shí)心肌組織的P-Cx43/T-Cx43的比值明顯降低，說明Cx43的磷酸化程度明顯降低，與急性缺血心肌組織表現(xiàn)相似。

趙立明等[19]研究發(fā)現(xiàn)一氧化碳中毒后大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)彌漫性心肌細(xì)胞線粒體腫脹，線粒體嵴減少，有些嵴溶解消失而變空。而本研究中觀察到ACOP組大鼠心肌的超微結(jié)構(gòu)病理變化類似TRITAPEPE等[20]的報(bào)道?？梢娦募〖≡w維水腫，肌節(jié)斷裂，糖原顆粒減少。閏盤結(jié)構(gòu)模糊不清，部分閏盤融合消失。與本課題組近期研究的容量超負(fù)荷心力衰竭大鼠左心室心肌縫隙連接/Cx43的重構(gòu)相似：心力衰竭時(shí)心肌的縫隙連接受損，連續(xù)性中斷，部分縫隙連接溶解消失，電子密度降低；Cx43分布模式發(fā)生明顯改變，不是集中于細(xì)胞閏盤處，而散在分布在細(xì)胞側(cè)面和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；Cx43表達(dá)總量明顯下降[21]。閏盤及縫隙連接結(jié)構(gòu)的改變與IHC顯示的Cx43分布變化相符，與文獻(xiàn)[22]報(bào)道一致。ACOP組大鼠心肌細(xì)胞部分閏盤消失，提示ACOP可導(dǎo)致細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，導(dǎo)致脫偶聯(lián)，且其改變呈非均勻性、非均質(zhì)性，這種非均質(zhì)性的縫隙連接改變較均質(zhì)性明顯增加折返性心律失常發(fā)生的可能性。

心臟是ACOP后最易受到損傷的器官，心肌組織中Cx43無序、紊亂分布，在ACOP后發(fā)生心律失常的機(jī)制中起著非常重要的作用，而心肌細(xì)胞和縫隙連接超微結(jié)構(gòu)的變化是其發(fā)病的解剖學(xué)基礎(chǔ)?？p隙連接/Cx43將成為ACOP后心肌損害的防控靶點(diǎn)。