陳俊宇，顧欣雨，顧靖釧，魚敏逸，甘衛(wèi)華，張愛青

(1 南京醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，南京 210011；2 南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院)

異常增殖的系膜細胞是腎小球病變中最常見的病理表現(xiàn)，見于各類原發(fā)性與繼發(fā)性腎炎[1]。異常增殖的系膜細胞可分泌大量炎癥因子引起系膜區(qū)基質(zhì)沉積，最終造成腎臟的不可逆損傷，甚至進展為終末期腎病[2,3]。目前臨床上主要通過免疫抑制劑等藥物控制炎癥因子，但治療效果不理想。研究[4]發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA(lncRNA)因其較長的核苷酸序列而擁有多個功能結合域與三維結構，能夠在多種分子信號通路中發(fā)揮調(diào)控作用，這提示了存在某種lncRNA成為系膜細胞增殖相關腎病防治的新靶點的可能性。本課題組前期以經(jīng)典的系膜細胞異常增生模型——TGF-β1處理的大鼠系膜細胞為研究對象，采用高通量lncRNA微矩陣芯片技術篩選，并在臨床患者腎活檢組織中通過Realtime PCR檢測驗證lncRNA-uc.412的特異性，發(fā)現(xiàn)lncRNA-uc.412的表達水平與系膜細胞增殖程度顯著相關，生物信息學分析結果顯示，lncRNA-uc.412基因全長268 bp，位于人類17號染色體q12片段[5]。為進一步研究lncRNA-uc.412在系膜細胞中的潛在作用，本研究構建了lncRNA-uc.412的重組質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染至大鼠腎小球系膜細胞，為探討lncRNA-uc.412在腎小球系膜細胞異常增殖相關腎病中作用的研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 大鼠腎小球系膜細胞、大腸桿菌XL-10購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，限制性內(nèi)切酶RsaⅠ和AluⅠ購自Promega公司，TRIzol試劑購自ThermoFisher公司，cDNA試劑盒、PCR試劑盒、RT-qPCR試劑盒、高保真DNA聚合酶、T4-DNA連接酶、嘌呤霉素、質(zhì)粒中抽試劑盒及DNA Marker均購自TaKaRa公司，β-actin、一抗、二抗均購自Proteintech Group公司，ECL發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術公司，pRP[Exp]載體質(zhì)粒(含有EGFP熒光標簽、嘌呤霉素抗性基因、CAG真核啟動子基因片段)購自北京普如汀生物技術有限公司，PCR上、下游引物購自上海捷瑞生物有限公司。

1.2 lncRNA-uc.412的引物設計、PCR擴增與提取 使用BLAST網(wǎng)站，根據(jù)lncRNA-uc.412基因組序列數(shù)據(jù)的功能編碼區(qū)序列和載體質(zhì)粒pRP[Exp]序列特點，分別選擇限制性內(nèi)切酶RsaⅠ和AluⅠ作為上、下游引物的酶切位點，設計出PCR引物序列：上游引物為5′-CGCGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCGAGCCTGCCTCTTGAAT-3′，下游引物為5′-CCCAGCTACCCTTCATTCAAATCCACACAAGC-3′。通過TRIzol法提取大鼠腎小球系膜細胞總RNA，核酸/蛋白質(zhì)定量熒光計分析測定RNA純度和濃度。取1 μg樣品，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明方法進行cDNA的合成；取1 μg cDNA加入PCR反應體系進行擴增：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應。以10 g/L的瓊脂糖凝膠為電泳介質(zhì)分離出PCR終產(chǎn)物中的目的基因片段，得到大小在200～300 bp的特異性條帶。目的基因片段大小與預期得到的擴增長度相符，提示成功提取出lncRNA-uc.412基因片段。切取相關凝膠并通過回收試劑盒獲取與純化lncRNA-uc.412基因片段。

1.3 lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的構建 將質(zhì)粒pRP[Exp]與PCR擴增所得的lncRNA-uc.412基因片段分別經(jīng)含RsaⅠ和AluⅠ的雙酶體系處理，酶切后產(chǎn)物通過凝膠電泳分離純化，統(tǒng)一收回后混合并加入T4-DNA連接酶，16 ℃過夜，即獲得lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒。

1.4 lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定與測序 ①lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定。將大腸桿菌XL-10用42 ℃水浴加熱10 min轉(zhuǎn)至感受態(tài)，4 ℃降溫3 min后，將其與lncRNA-uc.412重組質(zhì)?；旌?，使用移液器轉(zhuǎn)移500 μL含質(zhì)粒與大腸桿菌的混合物至含有嘌呤霉素的LB固體培養(yǎng)基上，涂菌棒均勻涂布，倒置于37 ℃恒溫箱中過夜后，挑取單克隆菌接種于含1 mL LB液體培養(yǎng)基的離心管中，37 ℃搖菌1 h后，各取150 μL分別接種于含有嘌呤霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶中，37 ℃搖菌16 h，根據(jù)質(zhì)粒中抽試劑盒使用說明方法裂解細菌、提取質(zhì)粒，使用Rsa Ⅰ和Alu Ⅰ酶處理重組質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒中的lncRNA-uc.412基因片段。將lncRNA-uc.412基因片段與DNA Marker混合進行瓊脂糖凝膠電泳分離，檢測目的基因片段大小。②lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的測序。選取經(jīng)雙酶切鑒定連接成功的lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒，PCR擴增后送往南京金斯瑞生物科技有限公司進行雙向測序，使用儀器為DNA全自動測序儀。

1.5 lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染與觀察 使用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞，胰酶聯(lián)合EDTA消化貼壁生長的腎小球系膜細胞，稀釋細胞濃度至2×105/L，分別轉(zhuǎn)移2 mL細胞懸浮液至6孔板中，24 h后觀察到細胞貼壁后換液，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒和空白質(zhì)粒pRP[Exp]，分別記為實驗組和陰性對照組，轉(zhuǎn)染6 h后換液，48 h后消化收集細胞，離心去上清后加入DEPC無菌水，-20 ℃保存。以Rsa Ⅰ和Alu Ⅰ酶作為上、下游引物的酶切位點設計PCR引物序列：上游引物為5′-CTTGAATTCCAAGCAGCACA-3′，下游引物為5′-CAGCAATTAATCCCCCAAGA-3′。通過TRIzol法提取實驗組和陰性對照組細胞的總RNA，以GAPDH為內(nèi)參進行RT-qPCR擴增：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)，每個循環(huán)收集一次熒光信號以建立擴增曲線；95 ℃預變性15 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，監(jiān)測該反應條件下熒光信號隨溫度的變化并建立溶解曲線以驗證擴增產(chǎn)物的特異性。用2-ΔΔCt表示大鼠腎小球系膜細胞中l(wèi)ncRNA-uc.412的相對表達量。

2 結果

2.1 lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定與測序結果 ①lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結果顯示，得到大小在200～300 bp的特異性條帶，與lncRNA-uc.412的長度相符，見圖1。②測序結果顯示，lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的堿基序列與理論預期序列一致，見圖2。

圖1 lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物電泳條帶

圖2 lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的部分堿基序列

2.2 lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒在大鼠腎小球系膜細胞中的表達觀察 以轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒pRP[Exp]的陰性對照組中大鼠系膜細胞中l(wèi)ncRNA-uc.412的相對表達量為標準，記為1.00±0.00，實驗組大鼠腎小球系膜細胞中l(wèi)ncRNA-uc.412的相對表達量為8.01±0.97，兩組相比，P<0.05。

3 討論

研究[6，7]顯示，不編碼任何蛋白質(zhì)的lncRNA可作為重要的調(diào)控分子發(fā)揮多種生物學功能，甚至已有l(wèi)ncRNA被證實能與某些增殖調(diào)控相關的信號因子相互作用，如lncRNA-MEG3可直接與p53基因結合進而激活p53介導的下游反應，lncRNA-HULC可通過HULC抑制miR-15a的成熟而減少PTEN的表達。lncRNA的作用方式多樣，研究[8～10]顯示，lncRNA一方面能通過堿基互補配對原則與DNA或RNA結合，激活或沉默靶向DNA的表達，或者與miRNA形成無功能結合從而抑制miRNA的表達；另一方面，lncRNA憑借其較長的堿基序列長度擁有三維結構域與多個功能域，三維結構能使lncRNA直接結合蛋白質(zhì)，激活下游蛋白的活性或提高其穩(wěn)定性，多個功能域的特性使lncRNA能作為誘餌分子招募多種信號分子的定向聚集并發(fā)生反應，這些都是lncRNA-uc.412可能的作用方式與研究方向[11]。

本研究成功構建了lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜帶有l(wèi)ncRNA-uc.412基因全長序列、EGFP熒光標簽、嘌呤霉素抗性基因puro、CAG真核啟動子。其中，EGFP有利于比較質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率；嘌呤霉素抗性基因puro有助于質(zhì)粒擴展或轉(zhuǎn)染后的篩選；CAG啟動子有助于lncRNA-uc.412的高表達，為對比觀察lncRNA-uc.412生物學功能與相關信號通路提供基礎。

目前尚無有關系膜細胞增殖相關腎病與lncRNA-uc.412的研究報道，而本研究成功轉(zhuǎn)染了lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒至大鼠系膜細胞內(nèi)，并特異性提高了轉(zhuǎn)染后大鼠系膜細胞的lncRNA-uc.412的表達水平，該結果對于腎病發(fā)生發(fā)展的進一步研究有很大意義，為探索系膜細胞增殖相關腎病的分子學相關通路提供了新的思路。有研究[12]顯示，系膜細胞雖然不參與濾過屏障的構成，但與血管內(nèi)皮細胞、足細胞直接相鄰，三者的病理改變往往引起互相之間的繼發(fā)性損傷，而lncRNA-uc.412的表達水平與系膜細胞的異常增殖密切相關，lncRNA-uc.412可能在各種原發(fā)性與繼發(fā)性腎損傷中扮演重要角色。另一方面，lncRNA-uc.412作為作用方式多樣的lncRNA，可能通過作用于多種信號通路或在參與病理狀態(tài)下系膜細胞增殖的調(diào)控，甚至可能因病理時期的不同而作用于不同的調(diào)控路徑，出現(xiàn)雙向調(diào)控的特性，如lncRNA H19就被發(fā)現(xiàn)了這種調(diào)控特點。研究[13]結果顯示，系膜細胞增殖的調(diào)控在不同病理時期涉及多種不同的信號通路。在增殖前，NADPH氧化酶的啟動、轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)的磷酸化、炎癥相關基因(如TNF-α、IL-6等)的表達增加，都可促使了系膜細胞的異常增殖；在增殖過程早期，血小板衍生因子B直接誘發(fā)了系膜細胞的增殖與細胞外基質(zhì)的合成增加[14,15]；在增殖后期，p53/Caspase-8或PTEN-PI3K/AKT信號通路的激活誘導了系膜細胞的自噬與凋亡，從而抑制細胞過度增殖并保護腎功能[16,17]。

綜上所述，本研究成功構建了lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染至大鼠腎小球系膜細胞，為進一步深入研究lncRNA-uc.412在腎小球系膜細胞中的生物學功能與探索腎小球系膜細胞增殖相關腎病的防治奠定了基礎。