高樹(shù)廣，徐博涵，張春花，王瑞霞，趙 輝，倪云霞，劉紅彥，楊光宇，李偉峰

（1.周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南周口466001；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，河南鄭州450002）

芝麻是最古老的油料作物之一[1]，在溫帶、熱帶地區(qū)廣泛種植[2-3]，但是芝麻單產(chǎn)不穩(wěn)定，除受遺傳因素影響外，病、蟲(chóng)、草等生物因子或漬、旱等非生物因子的脅迫，也是造成芝麻單產(chǎn)低而不穩(wěn)的重要因素[4-5]，其中，莖點(diǎn)枯病是世界范圍內(nèi)危害芝麻最嚴(yán)重的土傳、種傳真菌病害之一，在我國(guó)常年發(fā)病率20%左右，發(fā)病嚴(yán)重的田塊達(dá)到80%以上，重病田幾乎顆粒無(wú)收，不但影響芝麻的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且嚴(yán)重影響芝麻生產(chǎn)的機(jī)械化[6-7]。芝麻莖點(diǎn)枯病菌為菜豆殼球孢，學(xué)名Macrophomana phaseolina（Tassi），Goid.），簡(jiǎn)稱(chēng)M. phaseolinna，抗逆能力很強(qiáng)[8]，寄主廣泛，能侵染芝麻、大豆、向日葵、玉米、大豆、煙草、蓖麻、番茄、棉花等500 多種作物[9-10]。

植物病理學(xué)認(rèn)為，細(xì)胞壁降解酶是病原菌“基本的親和因子”，它們是病菌侵染、擴(kuò)展、從植物中獲取營(yíng)養(yǎng)所必需的，不同的病原菌在致病過(guò)程中分泌的細(xì)胞壁降解酶種類(lèi)和作用不同，多種細(xì)胞壁降解酶協(xié)同作用，是病原真菌降解宿主組織的重要機(jī)制。陳捷等[11]研究表明，玉米莖腐病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶在胚根組織的降解中起重要作用；水稻紋枯病菌通過(guò)產(chǎn)生的多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基半乳糖醛酸酶和纖維素酶侵染水稻葉鞘[12]。植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠和蛋白質(zhì)等構(gòu)成[13]，半纖維素和木質(zhì)素在高等植物細(xì)胞中分布廣泛，二者通過(guò)共價(jià)結(jié)合包裹纖維素，形成穩(wěn)固的超分子體系，此分子體系不但增強(qiáng)植物體的機(jī)械強(qiáng)度，而且能防止有害生物和過(guò)多水分滲入細(xì)胞壁，起到保護(hù)和支持作用。木質(zhì)素主要分布在胞間層和次生內(nèi)壁，作為纖維素外圍基質(zhì)，保護(hù)纖維素免受降解酶進(jìn)攻和微生物襲擊。木質(zhì)素降解的胞外酶主要包括漆酶（Lac）、錳過(guò)氧化物酶（MnP）、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP）及一些輔助酶[14-15]。半纖維素是一種異質(zhì)多聚體，由不同類(lèi)型的五碳糖和六碳糖構(gòu)成，木聚糖是主要的組成成分。半纖維素酶是木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶和阿拉伯半乳糖酶等多組酶的總稱(chēng)[16]。陳曉林等[17]研究表明，細(xì)胞壁降解酶是蘋(píng)果腐爛病菌的主要致病因子，致病性強(qiáng)的菌株木聚糖酶活性顯著高，并且酶活力峰值出現(xiàn)也比較早。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)莖點(diǎn)枯病癥狀的描述、發(fā)生規(guī)律和防治方法等研究較多，而對(duì)病原菌致病機(jī)制的研究相對(duì)薄弱[18-20]，因此，明確芝麻莖點(diǎn)枯病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶種類(lèi)及活性，對(duì)進(jìn)一步研究芝麻莖點(diǎn)枯病菌與寄主的互作機(jī)制具有重要意義。

本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定芝麻莖點(diǎn)枯病菌產(chǎn)生的纖維素降解酶種類(lèi)及活性大小，為芝麻莖點(diǎn)枯病菌侵染寄主的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 7 株芝麻莖點(diǎn)枯病菌均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物防治研究室分離和保存（表1）。

表1 供試菌株

1.1.2 試劑與儀器 木糖、木聚糖、藜蘆醇和ABTS購(gòu)自北京索萊寶生物科學(xué)技術(shù)有限公司，均為色譜純；pH 計(jì)為Sartorius PB-10，分光光度計(jì)為島津紫外分光光度計(jì)-UV2450。

1.1.3 培養(yǎng)基 芝麻稈粉：芝麻稈洗凈、蒸餾水沖洗2 遍，80 ℃烘干，粉碎至0.177 mm，2 mol/L NaOH溶液（固液質(zhì)量比為1∶4）處理12 h，水洗至pH 中性，烘干備用[21]；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：芝麻稈粉20 g，NH4Cl 2.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Na2HPO40.2 g，CuSO4·5H2O 0.007 g，MnSO40.035 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.007 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值調(diào)至6.8～7.0[22]；DNS 試劑：6.5 g 3，5- 二硝基水楊酸溶于少量蒸餾水中，加入325 mL 2 mol/L 的NaOH 溶液、45 g 丙三醇，搖勻冷卻后定容至1 000 mL[23]。

1.2 方法

1.2.1 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 取7 支潔凈的10 mL EP 管分別加入一定體積的2 mg/mL 的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，不加標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白對(duì)照，ddH2O 定容至2 mL，配制成木糖梯度濃度溶液，搖勻后分別加入2 mL DNS 溶液，搖勻后沸水浴5 min，取出冷至室溫，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），以木糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為縱坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的吸光度為橫坐標(biāo)，繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.2 粗酶液制備 將斜面保存的菌株接至PDA平板上，30 ℃黑暗培養(yǎng)2 d，從菌落邊緣打菌餅轉(zhuǎn)至新的PDA 平板上，30 ℃培養(yǎng)2 d，菌落邊緣打菌餅（直徑為6 mm）轉(zhuǎn)接至含200 mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中，30 ℃，160 r/min 振蕩培養(yǎng)，以不接菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，3 次重復(fù)，每次取樣8 mL，4 ℃，10 000 r/min 離心10 min，上清液即為粗酶液[24]，采用3，5- 二硝基水楊酸法（DNS法）測(cè)定酶活力。

1.2.3 木聚糖酶活測(cè)定 潔凈干燥10 mL EP 管中加入1.5 mL1%木聚糖緩沖液，然后加入酶液0.5 mL，50 ℃水浴中保溫30 min，反應(yīng)完畢后，立即取出，加入2 mL DNS 溶液終止酶反應(yīng)。充分搖勻后沸水浴5 min，冰浴冷卻，在540 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定OD 值，從第2 天開(kāi)始，每隔1 天測(cè)定一次。根據(jù)OD 值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查找木糖濃度，再根據(jù)木糖濃度計(jì)算出相應(yīng)的酶活力。酶活力單位（U/mL）定義為：1 mL 酶液1 min 催化底物水解生成1 μmol 木糖[24]，酶活力計(jì)算公式如下。

酶活力（U）＝木糖質(zhì)量濃度（mg/mL）×反應(yīng)液體積（mL）×6.67（μmol/mg）/反應(yīng)液中加入酶液體（mL）×?xí)r間（min） （1）

其中，6.67 為1 mg 木糖的μmol 數(shù)。

1.2.4 木質(zhì)素降解酶活測(cè)定 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP）測(cè)定：病原菌液體發(fā)酵培養(yǎng)14 d 制取粗酶液，藜蘆醇法[25]測(cè)定木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活力，2.6 mL反應(yīng)液（80 mmol/L、pH 值3.0 的酒石酸鈉緩沖液，5 mmol/L 藜蘆醇）中加入0.3 mL 酶液，首先預(yù)熱至37 ℃，往此反應(yīng)液中加入0.1 mL 10 mmol/L H2O2啟動(dòng)酶促反應(yīng)，測(cè)定310 nm 吸光度在2 min 內(nèi)的變化。單位時(shí)間內(nèi)1 mL 酶液使反應(yīng)體系吸光度增加0.01 定義為1 個(gè)酶活力單位（U）。

錳過(guò)氧化物酶（MnP）測(cè)定：病原菌液體發(fā)酵培養(yǎng)14 d 制取粗酶液，二價(jià)錳氧化法測(cè)定錳過(guò)氧化物酶活力[26]，在4.0 mL 反應(yīng)體系中，含有3.4 mL 50 mmol/L乳酸鈉緩沖液（pH 值4.5）、0.1 mL1.6 mmol/L 硫酸錳溶液，酶液0.4 mL，預(yù)熱至37 ℃，然后加入0.1 mL1.6 mmol/LH2O2溶液?jiǎn)?dòng)酶促反應(yīng)，240 nm處測(cè)定最初4 min 內(nèi)吸光度的變化。單位時(shí)間內(nèi)1 mL酶液使反應(yīng)體系吸光度增加0.01 定義為1 個(gè)酶活力單位（U）。

漆酶（Lac）測(cè)定：病原菌液體發(fā)酵培養(yǎng)14 d 制取粗酶液，ABTS 法測(cè)定漆酶活力[27]，在4.0 mL 反應(yīng)體系中含有0.3 mL 0.3 mmol/L 的ABTS、3.65 mL 檸檬酸- 磷酸鹽緩沖液（pH 值2.6），酶液0.05 mL，混合后在420 nm 處測(cè)定最初5 min 內(nèi)吸光值的變化。每分鐘吸光值變化0.01 單位所需要的酶量為一個(gè)Lac 酶活力單位。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

以吸光度為橫坐標(biāo)、木糖質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到木糖對(duì)應(yīng)線(xiàn)性方程為y＝0.165 4x＋0.001 6（R2＝0.999 9）（圖1），標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系良好，可用于酶活力測(cè)定。

2.2 木聚糖酶活分析

從圖2 可以看出，接種第2 天就有一定的產(chǎn)酶量，取樣7 次，7 株病原菌均能檢測(cè)到木聚糖酶，表明7 個(gè)菌株均能分泌胞外降解木聚糖的酶。各菌株酶活性均高于第2 天測(cè)定結(jié)果，并且達(dá)到峰值的時(shí)間不同（表2），其中，2010003 達(dá)到峰值所用時(shí)間最短，在第6 天達(dá)到峰值，其余菌株在第12 天出現(xiàn)峰值，其峰值大小依次是2010082＞2010003＞2010028＞2010032＞G243＞2010010＞2010064，其中，2010082峰值最大（2.538），2010064 峰值最小（1.533）；參照病害嚴(yán)重度進(jìn)展曲線(xiàn)下面積（AUDPC）法計(jì)算酶活性發(fā)展曲線(xiàn)下面積（the area under enzyme activity progresscurve，AUEAPC，簡(jiǎn)稱(chēng)A值），7 個(gè)菌株A值[28-29]差異極顯著，從大到小依次為2010003＞2010082＞2010028＞2010032＞G243＞2010010＞2010064，其中，2010003 的A 值最高（26.634），2010064 的A 值最低（16.130）。

表2 芝麻莖點(diǎn)枯病菌木聚糖酶活力峰值和A 值差異比較

2.3 木質(zhì)素降解酶活性分析

木質(zhì)素降解酶測(cè)定結(jié)果顯示，7 株病原菌都能檢測(cè)到木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶，但均未檢測(cè)到錳過(guò)氧化物酶。同一菌株不同酶相比較，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性都明顯高于漆酶活性（圖3）；對(duì)不同菌株木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、漆酶進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明，菌株2010028 的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性（3.522）和漆酶活性（0.783）均最高，G243 的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性最低（0.656），2010082 的漆酶活性最低（0.099）（表3）。

表3 芝麻莖點(diǎn)枯病菌木質(zhì)素降解酶活性不同菌株之間多重比較

3 討論

研究病原菌的致病因子是明確其致病機(jī)制和探索植物抗病途徑的重要基礎(chǔ)，大多數(shù)植物病原菌都能分泌各種細(xì)胞壁降解酶，不同病原菌分泌細(xì)胞壁降解酶種類(lèi)不同，同一種病原菌不同菌株分泌同一種酶的活力大小也存在差異[30]。試驗(yàn)結(jié)果表明，以芝麻秸稈為唯一碳源的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)不同地區(qū)采集的7 株芝麻莖點(diǎn)枯病菌，從培養(yǎng)液中制取的粗酶液中都能檢測(cè)到木聚糖酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶，但是未檢測(cè)到錳過(guò)氧化物酶，說(shuō)明7 株病原菌都具有降解半纖維素和木質(zhì)素的能力。7 株病原菌接種第2 天就能檢測(cè)到木聚糖酶活性，在培養(yǎng)的14 d 中能持續(xù)產(chǎn)生木聚糖酶，并且每天的酶活力不同，出現(xiàn)酶活力峰值的時(shí)間不同，以A 值作為木聚糖酶綜合活性高低的依據(jù)[31]，不同菌株之間差異顯著，2010003 綜合活性最高，2010064 綜合活性最低；不同菌株木質(zhì)素降解酶活力差異比較顯著，無(wú)論是木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活力還是漆酶活力，2010028 都顯著高于其他菌株。同一種酶不同菌株活力大小差異比較顯著，是由于病原菌產(chǎn)生胞外細(xì)胞壁降解酶的機(jī)制比較復(fù)雜，除受底物誘導(dǎo)外，還與基因調(diào)控和環(huán)境因子有關(guān)，作為芝麻莖點(diǎn)枯病菌的致病因子，推測(cè)木聚糖酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶在不同菌株入侵、擴(kuò)展中起作用大小不同。另外，芝麻莖點(diǎn)枯病菌侵染芝麻，除細(xì)胞壁降解酶外，還有激素和毒素等因子的共同作用才能致病，是一個(gè)復(fù)雜的生化過(guò)程；同時(shí)，病原菌侵染也會(huì)激活植物防御酶系統(tǒng)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來(lái)抑制病原菌細(xì)胞壁降解酶，以達(dá)到抗病的目的[32]。因此，本試驗(yàn)為芝麻莖點(diǎn)枯病菌與寄主互作機(jī)制研究奠定了重要基礎(chǔ)，要徹底明確芝麻莖點(diǎn)枯病菌產(chǎn)生的纖維素降解酶對(duì)病原菌入侵寄主、病斑擴(kuò)展的影響及其致病機(jī)制，根據(jù)病原菌致病因子鑒定程序，還需將病原菌以及分離純化之后的酶，接種活體芝麻，對(duì)病原菌的致病性強(qiáng)弱及致病性強(qiáng)弱與這幾種酶的相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步探討[17]。