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        雞堆型艾美耳球蟲早熟株免疫效力分析及安全性評價

        2019-09-23 01:23:30康慧鑫鄭明學(xué)張雪松李瑞琪郝思源
        山西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年9期
        關(guān)鍵詞:記分卵囊球蟲病

        康慧鑫,王 麗,鄭明學(xué),白 瑞,張 黎,張雪松,李瑞琪,郝思源,白 冰

        (山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山西太谷030801)

        雞球蟲病是專性寄生于家禽腸道上皮細胞內(nèi)的一種寄生蟲病,誘發(fā)雞只腸炎并伴有腹瀉,因其多發(fā)、危害嚴重、防治困難,造成了巨大的經(jīng)濟損失[1-3]。在已知的9 種雞球蟲中,堆型艾美耳球蟲流行率最高,分布廣泛,致病性較強,養(yǎng)殖中以混合感染常見[4-5]。

        目前雞球蟲病仍以藥物防治為主,但蟲株的耐藥性以及因藥殘而引起的食品安全問題[6-9]日趨嚴重。在治療傳染病時,最有效的方法之一就是接種疫苗以誘導(dǎo)保護性免疫[10],疫苗免疫具有無殘留、效果確實、一次免疫終生保護等優(yōu)點[11]。目前,商用的雞球蟲病疫苗有強毒活疫苗和弱毒活疫苗,由球蟲親本株制備的強毒活疫苗雖免疫效果良好,但因其致病力強、安全性差,易引起球蟲病暴發(fā);而由球蟲親本株選育出的早熟弱毒球蟲疫苗因其安全性高、免疫效果好,得到廣泛推廣應(yīng)用[12-14],故早熟選育弱毒株仍是雞球蟲病疫苗的主要研究方向。

        山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院獸醫(yī)病理實驗室已獲得免疫原性良好、遺傳穩(wěn)定[15]的雞堆型艾美耳球蟲(Eimeria acervulina)早熟株,其二次免疫的最小免疫劑量為首免1 羽份(400 個/羽),二免2 羽份(800 個/羽)[16]。作為弱毒疫苗蟲株之一,Eimeria acervulina 早熟株的最小首免日齡、二次免疫間隔時間及安全性如何還有待研究。

        本試驗對Eimeria acervulina 早熟株進行效力試驗、實驗室安全性試驗等基礎(chǔ)性研究,為雞球蟲早熟株疫苗研究提供理論依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 蟲株

        雞堆型艾美耳球蟲(Eimeria acervulina)早熟株(Eap20,PAsx)和強毒株(Ea02,Asx)由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院獸醫(yī)病理實驗室保存并提供。

        1.2 試驗動物

        供試雞為1 日齡SPF 雛雞,由北京梅里亞維通試驗動物技術(shù)有限公司提供SPF 種雞蛋孵化而來。

        1.3 Eimeria acervulina 早熟株免疫效力試驗

        1.3.1 最小首免日齡篩選試驗 將體質(zhì)量相近的120 只1 日齡SPF 雛雞隨機分為12 組,每組10 只雞,分別為Eimeria acervulina 早熟株(PAsx)免疫攻毒組T1~T4、攻毒對照組C1~C4 和空白組C01~C04。T1~T4 組分別以1 羽份[16]于第1,2,4,6 日齡首免,首免后10 d 以2 羽份二免。二免后14 d 空腹稱質(zhì)量,對T1~T4 和C1~C4 組經(jīng)口接種20 萬個卵囊/羽強毒株(Asx)。攻毒第8 天各組雞只稱質(zhì)量、剖檢,進行十二指腸病變記分、卵囊排出量測定,計算相對增質(zhì)量率、病變記分減少率(RLS)、卵囊減少率和抗球蟲指數(shù)(ACI),來篩選其作為疫苗蟲株使用的最小首免日齡。

        1.3.2 免疫間隔期篩選試驗 將150 只體質(zhì)量相近的1 日齡SPF 雛雞隨機分為15 組,每組10 只雞,分別為免疫攻毒組TA1~TA5、攻毒對照組TB1~TB5 和空白組CA1~CA5。于4 日齡用400 個孢子化卵囊/ 羽PAsx 對TA1 ~TA5 組首免,間隔3,5,7,9,11 d 進行二免。二免后第14 天稱質(zhì)量,對TA1~TA5 和TB1~TB5 組經(jīng)口接種20 萬個卵囊/羽Eimeria acervulina 強毒株,攻毒后觀察和測定指標同1.3.1,確定疫苗蟲株2 次免疫的免疫間隔期。

        1.4 Eimeria acervulina 早熟株實驗室安全性試驗

        1.4.1 一次單劑量接種 將體質(zhì)量相近的4 日齡SPF 雛雞隨機分為2 組,每組10 只雞,接種組TC1組接種PAsx 疫苗蟲株推薦免疫劑量的1 羽份/只疫苗蟲株,CC1 組為空白對照組。觀察各試驗組雞臨床癥狀及死亡雞數(shù),于接種后第14 d 稱質(zhì)量、剖檢,觀察各器官病理變化,進行十二指腸平均病變記分,計算相對增質(zhì)量率。取各組雞的肝、腎、心、十二指腸、小腸中段制作組織切片,進行病理組織學(xué)檢查。

        1.4.2 單劑量重復(fù)接種 將體質(zhì)量相近的4 日齡SPF 雛雞隨機分為2 組,每組10 只雞,接種組TD2組接種PAsx 疫苗蟲株,CD2 組為不接種空白對照組。接種組于14,28 日齡分別以疫苗蟲株推薦免疫劑量1 羽份/只、2 羽份/只接種,隔離飼養(yǎng)。試驗期和觀察指標同1.4.1。

        1.4.3 一次超劑量接種 將體質(zhì)量相近的4 日齡SPF 雛雞隨機分為6 組,每組10 只雞,接種組TE3、TE4、TE5、TE6(接種蟲株同TC5 組)組分別接種20倍(16 000 個卵囊/只)二次免疫推薦使用劑量的三批PAsx 疫苗蟲株,CE3、CE4 組為不接種空白對照組,隔離飼養(yǎng)。TE3、TE4、TE5 組和CE3 組試驗期和觀察指標同1.4.1。TE6 組和CE4 組于接種后第7 天稱質(zhì)量、剖檢,進行平均病變記分并計算相對增質(zhì)量率。

        1.5 判定指標

        相對增質(zhì)量率=感染組雞平均增質(zhì)量/健康對照組雞平均增質(zhì)量×100% (1)

        死亡率=組內(nèi)死亡雞數(shù)/組內(nèi)總雞數(shù)×100% (2)

        OPG 是指1 g 糞便中含有的卵囊數(shù)目;腸道病變記分、十二指腸的病變記分參照JOHNSON 等[17]、蔡秀敏[4]的方法。

        RLS=(不免疫攻毒組的平均病變記分-免疫攻毒組的平均病變記分)/不免疫攻毒組的平均病變記分×100% (3)

        卵囊減少率=(不免疫攻毒組卵囊平均產(chǎn)量-免疫攻毒組卵囊平均產(chǎn)量)/不免疫攻毒組卵囊平均產(chǎn)量×100% (4)

        ACI=(存活率+相對增質(zhì)量率)×100-(病變值+卵囊值)[17](5)

        免疫效果判定標準:綜合分析各項指標,將死亡率為0、相對增質(zhì)量率≥80%、十二指腸病變記分≤1、RLS≥70%、卵囊減少率≥75%和ACI≥180判定為免疫效果良好。

        1.6 數(shù)據(jù)處理

        試驗結(jié)果用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行方差分析,并用Prism 6.0 軟件進行繪圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 Eimeria acervulina 早熟株效力試驗研究

        2.1.1 最小首免日齡篩選試驗 各免疫攻毒組雞群的精神狀態(tài)良好,未見死亡,TI~T4 組的相對增質(zhì)量率、卵囊減少率、病變記分減少率、抗球蟲指數(shù)均逐漸增高,與首免日齡呈正相關(guān)。T3、T4 組相對增質(zhì)量率均≥97.7%,平均病變記分≤0.8,RLS≥77.1%,卵囊減少率均≥95.0%,抗球蟲指數(shù)均≥189.7,達到良好免疫效果(圖1)。

        2.1.2 不同免疫間隔期對免疫效力的影響Eimeria acervulina 早熟株以最小免疫劑量接種雛雞,2 次免疫間隔在3~11 d,隨著二次免疫間隔時間的延長,免疫攻毒組雞的相對增質(zhì)量率、卵囊減少率、病變記分減少率、抗球蟲指數(shù)升高。TA1~TA5 組病變記分均<1,且差異不顯著(P>0.05),RLS 均≥85.3,ACI 均≥182.4,卵囊減少率均≥90%,但免疫攻毒TA1、TA2 組平均增質(zhì)量極顯著低于TA3、TA4、TA5 組(P<0.01)(圖2)。

        2.2 Eimeria acervulina 早熟株安全性試驗

        2.2.1 一次單劑量接種 試驗雞群精神狀態(tài)良好,死亡率為0。第14 天剖檢,各腸道未見眼觀病變,病變記分為0.0,接種組雞只的相對增質(zhì)量率大于80%(圖3)。

        鏡檢發(fā)現(xiàn),接種雞十二指腸絨毛上皮細胞少量脫落,十二指腸和空腸均可見發(fā)育不同階段的蟲體,其余組織均未見異常。

        2.2.2 單劑量重復(fù)接種 試驗雞群精神狀態(tài)良好,死亡率為0。重復(fù)接種14 d 后剖檢雞只,各腸道均無眼觀病變,病變記分為0.0,對照組也未見眼觀病變(圖3)。

        鏡檢發(fā)現(xiàn),試驗雞十二指腸腸腔結(jié)構(gòu)較完整,絨毛上皮細胞少量脫落;十二指腸和空腸均可見發(fā)育不同階段的蟲體,其余組織均未見異常。

        2.2.3 一次超劑量接種 三批疫苗蟲株16 000 個卵囊/只劑量接種組,雞只精神狀態(tài)未見異常,死亡率為0;第7 天剖檢發(fā)現(xiàn),個別雞十二指腸黏膜有少量散在白色結(jié)節(jié),平均病變記分為1.0,其他腸道未見明顯眼觀病變;14 d 后剖檢發(fā)現(xiàn)試驗組與對照組雞只各腸段均無明顯眼觀病變,平均病變記分為0(圖3)。

        鏡檢發(fā)現(xiàn),第7 天剖檢雞只十二指腸大量腸絨毛從基底部斷裂,絨毛上皮細胞大量脫落;接種后14 d 雞只十二指腸部分絨毛斷裂,絨毛上皮細胞大量脫落;第7 天與第14 天剖檢雞十二指腸和空腸均可見發(fā)育不同階段的蟲體,其余組織均未見異常。

        3 討論

        弱毒活疫苗是依據(jù)活卵囊脫囊后在腸道內(nèi)周期性繁殖來獲得免疫保護,因此,免疫日齡的選擇也是其免疫是否成功的關(guān)鍵一步。首免日齡不宜過小或過大,球蟲脫囊需借助足夠的膽汁和胰凝乳蛋白酶以及肌胃的機械碾磨,接種日齡過小時,其肌胃、腸道機能不完善,致使其無法進行內(nèi)生性發(fā)育以刺激雞體產(chǎn)生免疫反應(yīng);接種日齡過大,可能造成在免疫保護力產(chǎn)生前就已感染外界野毒。

        張龍現(xiàn)等[18]研究發(fā)現(xiàn),EimerCox plus 雞球蟲活苗最適免疫日齡為5 日齡。本試驗結(jié)果表明,隨首免日齡增大,各試驗組的相對增質(zhì)量率、卵囊減少率、RLS、ACI 逐漸增高,4~6 日齡首免均可取得良好的免疫效果,以4 日齡為最小首免日齡。

        球蟲病康復(fù)雞對再感染有抵抗力[19],但若缺乏再感染,隨時間延長,雞對球蟲的免疫力會減弱;使用一定數(shù)量卵囊對雞進行免疫時,小劑量反復(fù)接種的免疫效果優(yōu)于一次大劑量接種[20],這是因為免疫次數(shù)少,產(chǎn)生的免疫滴度低,不能很好的預(yù)防球蟲病發(fā)生,而二次免疫可使抗體水平迅速提高,且免疫產(chǎn)生的抑制期較短。本試驗將免疫間隔選擇在3 d以上,結(jié)果表明,隨著免疫間隔時間的增加,免疫攻毒雞的相對增質(zhì)量率、病變記分減少率、抗球蟲指數(shù)均呈上升趨勢,可見在最適時間進行二次免疫,對雛雞有促生長作用,并可增強免疫力。本試驗結(jié)果表明,雖然二免間隔3~11 d 均可達到良好的保護效果,但二免間隔3~5 d 的攻毒組雞的相對增質(zhì)量明顯低于間隔7 d 以上的二免組,故將二免間隔定為7 d。

        一次單劑量、單劑量重復(fù)和一次超劑量接種試驗結(jié)果表明,接種雞十二指腸絨毛斷裂數(shù)量與接種劑量呈正相關(guān),但重復(fù)接種時,雞體已獲得一定免疫力,所以,損傷相對要??;一次超劑量接種組個別雞十二指腸損傷較嚴重,這是由于大量蟲體在腸道內(nèi)行裂殖生殖,腸黏膜原有結(jié)構(gòu)被嚴重破壞,腸黏膜上皮細胞局灶性壞死、脫落,并進行炎癥反應(yīng)來抗損傷。三次安全性試驗中,雞只未見死亡,精神狀態(tài)良好,除20 倍劑量接種組個別雞只腸道損傷嚴重外,其余各組雞只腸絨毛完整,無血管破裂現(xiàn)象,雞群平均病變記分均≤1,相對增質(zhì)量率均在80%以上。說明本疫苗蟲株對健康雛雞均安全,符合安全性要求。

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