劉曉峰，石玉星，趙曉軍，蔡 瑾，張寶俊，任 璐

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山西太原030031；3.山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，山西太原030006）

植物內(nèi)生細(xì)菌（Plant endophytic bacteria）作為生活在宿主植物體內(nèi)而不引起明顯癥狀的一類特殊微生物，普遍存在于各種植物中，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性提高具有重要作用，近年來備受人們關(guān)注[1-3]。目前，人們已從經(jīng)濟(jì)作物[4-5]、糧食作物[6]、中藥材[7-9]和雜草[10]等多種植物體內(nèi)分離和篩選到具有促生和抗病作用的內(nèi)生細(xì)菌，說明植物內(nèi)生細(xì)菌在促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育和植物病害生物防治[11]中具有重要意義。此外，防御酶作為提高植物抗逆性的關(guān)鍵酶，已有研究發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA）同植物的抗旱、耐鹽和抗病性有關(guān)[12-15]；苯丙氨酸氧化酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）同植物抗病性關(guān)系密切[16]；而且有報(bào)道顯示，植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)宿主植物體內(nèi)防御酶活性有重要影響[17-19]。有關(guān)植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)宿主植物體內(nèi)防御酶活性的影響研究對(duì)進(jìn)一步明確其促生和抗病機(jī)制具有重要意義。

谷子（Setaria italica）屬禾本科黍族狗尾草屬，是我國北方地區(qū)主要糧食作物之一，其具有耐旱、耐瘠和耐貯存等特點(diǎn)，對(duì)旱作農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義[20-21]。隨著人們對(duì)有機(jī)食品觀念的加深，有機(jī)谷子生產(chǎn)成為目前谷子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要趨勢(shì)[22-23]。因此，減少化肥和化學(xué)農(nóng)藥使用量，開展谷子有機(jī)肥、病蟲害生物防治以及生物菌肥等研究和應(yīng)用成為谷子有機(jī)產(chǎn)業(yè)的重要推動(dòng)力。

本研究以山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜病害防治課題組前期篩選出的對(duì)谷子白發(fā)病菌和谷瘟病菌有良好抑制作用的曼陀羅內(nèi)生細(xì)菌MY1 為研究對(duì)象，通過測(cè)定其發(fā)酵液對(duì)谷子幼苗生長(zhǎng)及防御酶活性的影響，旨在明確內(nèi)生細(xì)菌MY1 對(duì)谷子的抗病促生作用，為谷子生產(chǎn)過程中“肥藥雙減”以及有機(jī)谷子生產(chǎn)技術(shù)的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試谷子品種為晉谷21 號(hào)。

1.2 供試菌株與培養(yǎng)基

曼陀羅內(nèi)生細(xì)菌MY1 分離自植物曼陀羅葉片組織；采用甘油冷凍保藏法，保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物化學(xué)保護(hù)實(shí)驗(yàn)室。

NA 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，pH 值7.0，定容至1 000 mL。

LB 培養(yǎng)液：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，pH 值7.0，定容至1 000 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 MY1 菌株發(fā)酵液對(duì)谷子幼苗促生作用的影響

1.3.1.1 種子液的制備 將保存的MY1 菌株在NA 平板上活化24 h 后，接種于LB 培養(yǎng)液中，于28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h 后得到種子液。

1.3.1.2 發(fā)酵液的制備 將MY1 菌株種子液按1%（V/V）的接種量接入LB 培養(yǎng)液中，于28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h，于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后，即得到MY1菌株的發(fā)酵液，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3 促生作用測(cè)定 取晉谷21 號(hào)種子，過篩去除秕谷后，選取大小均勻飽滿的種子，先后浸于1%NaClO 和75%乙醇中進(jìn)行表面消毒，并用無菌水沖洗3 次后，進(jìn)行播種；待幼苗長(zhǎng)出第4 片真葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)大小一致的幼苗留苗，并分別用MY1 發(fā)酵液原液、5倍、10倍、20倍、50倍、80倍、100倍稀釋的發(fā)酵液進(jìn)行灌根，每盆20 mL，5 d 后再次灌根，同時(shí)以等量清水作為對(duì)照，室溫培養(yǎng)，適時(shí)適量澆水，播種60 d 后測(cè)量株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量。

1.3.2 MY1 菌株發(fā)酵液對(duì)谷子防御酶活性的影響

1.3.2.1 樣品采集 以1.3.1 的方法播種晉谷21 號(hào)以及施用MY1 菌株發(fā)酵液，于處理10 d 后采用5 點(diǎn)法隨機(jī)取樣，采集各個(gè)處理谷子葉片20 g，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 組織勻漿的制備 準(zhǔn)確稱取谷子葉片組織，放入預(yù)冷的研缽中，按比例加入勻漿介質(zhì)（生理鹽水或0.1 mol/L pH 值7.0～7.4 磷酸鹽緩沖液），冰水浴條件下，充分研磨成勻漿，制備10%的勻漿液，于4 ℃、4 000 r/min 離心10 min，收集上清液即酶提取液，低溫保存?zhèn)溆茫粚⑷〉玫纳锨逡焊鶕?jù)不同組織，再用勻漿介質(zhì)稀釋成不同濃度，進(jìn)行最佳取樣量預(yù)試驗(yàn)。確定最佳取樣量后再進(jìn)行正式試驗(yàn)。

1.3.2.3 酶活性的測(cè)定方法 CAT、MDA、PAL、POD、PPO、SOD 酶活性測(cè)定均參照試劑盒操作步驟進(jìn)行，試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過Excel 2010 進(jìn)行整理和作圖，數(shù)據(jù)方差分析均采用SPSS 17.0 進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 MY1 菌株發(fā)酵液對(duì)谷子幼苗促生作用的影響

由圖1、圖2 可知，株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量及干質(zhì)量均隨著MY1 菌株發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增大而呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)，且以稀釋20 倍效果最好，幼苗株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別比對(duì)照顯著增加了30.15%，36.84%，20.25%和42.11%。當(dāng)發(fā)酵液稀釋倍數(shù)大于80 倍或小于10 倍時(shí)無促生效果；而當(dāng)稀釋倍數(shù)為10～80 時(shí)表現(xiàn)出不同程度的促生效果，說明MY1 菌株發(fā)酵液在一定低濃度下對(duì)谷子生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用，而高濃度時(shí)，則有一定的抑制作用。

2.2 MY1 菌株發(fā)酵液對(duì)過氧化氫酶（CAT）活性的影響

不同處理?xiàng)l件下，谷子葉片的CAT 活性如圖3所示，MY1 菌株發(fā)酵液在稀釋5 倍和100倍后可顯著提高谷子葉片的CAT 活性，且以稀釋100 倍效果最好，酶活性可達(dá)6.12 U/mg，但在促生效果較好的20倍稀釋液下該酶活性較低。

2.3 MY1 菌株發(fā)酵液對(duì)丙二醛（MDA）含量的影響

不同處理?xiàng)l件下，谷子葉片的MDA 含量如圖4所示，除了100倍發(fā)酵液處理葉片的MDA 含量與對(duì)照無顯著差異外，其他稀釋濃度的MY1 發(fā)酵液處理過的谷子葉片MDA 含量均顯著低于對(duì)照，且以20 倍稀釋液下谷子幼苗葉片中的MDA 含量最低，說明MY1 發(fā)酵液稀釋20 倍后對(duì)谷子植株的膜系統(tǒng)保持穩(wěn)定，抗逆性增強(qiáng)，對(duì)減少植物病害的發(fā)生具有明顯促進(jìn)作用。

2.4 MY1 菌株發(fā)酵液對(duì)苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響

不同處理?xiàng)l件下，谷子葉片的PAL 活性如圖5所示，10倍菌株發(fā)酵液處理葉片的PAL 活性顯著高于其他處理，酶活性可達(dá)70.18 U/g；5倍、20倍、80倍的MY1 發(fā)酵液處理過的谷子葉片的PAL 活性也顯著高于對(duì)照。說明5倍～80倍的MY1 菌株發(fā)酵液可以使谷子植株的抗病性增強(qiáng)，而發(fā)酵液原液處理的PAL 活性與對(duì)照間無顯著差異，說明菌株發(fā)酵液濃度過高反而會(huì)對(duì)植物抗逆性產(chǎn)生一定抑制作用。

2.5 MY1 菌株發(fā)酵液對(duì)過氧化物酶（POD）活性的影響

不同處理?xiàng)l件下，谷子葉片的POD 活性如圖6所示，谷子幼苗經(jīng)MY1 不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵液處理后，只有稀釋10 倍發(fā)酵液處理的谷子葉片POD 活性顯著高于對(duì)照，其他濃度處理與對(duì)照間均無顯著差異。

2.6 MY1 菌株發(fā)酵液對(duì)多酚氧化酶（PPO）活性的影響

不同處理?xiàng)l件下，谷子葉片的PPO 活性如圖7所示，谷子幼苗經(jīng)菌株MY1 發(fā)酵液的5 倍、10 倍和80 倍稀釋液進(jìn)行灌根處理后，同對(duì)照相比可顯著提高谷子葉片中的PPO 活性。

2.7 MY1 菌株發(fā)酵液對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

不同處理?xiàng)l件下，谷子葉片的總SOD 活性如圖8 所示，發(fā)酵液原液處理過的谷子葉片的SOD活性顯著高于清水對(duì)照處理，其余濃度處理的谷子SOD 活性與對(duì)照間無顯著差異或顯著低于對(duì)照。

3 結(jié)論與討論

目前，發(fā)現(xiàn)一些植物內(nèi)生細(xì)菌不僅具有良好的抑菌特性，還具有較好的促生作用[24]，隨著研究和認(rèn)識(shí)的不斷深入，植物內(nèi)生細(xì)菌同宿主之間互作關(guān)系的研究成為近年來的熱點(diǎn)。本研究探討了曼陀羅內(nèi)生細(xì)菌MY1 對(duì)谷子幼苗的促生作用，并對(duì)MY1菌株發(fā)酵液作用下谷子體內(nèi)防御酶活性的變化進(jìn)行了探究，結(jié)果表明，谷子幼苗株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增大而呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，其中以20 倍稀釋液效果最好。這與張艷麗[23]和曹玉欣[25]的研究結(jié)果相似。進(jìn)一步說明，MY1 不僅具有生防微生物較好的抗病性，而且還具有一定的促生特性，在谷子促生防病中的應(yīng)用潛力明顯。

內(nèi)生細(xì)菌MY1 對(duì)谷子幼苗體內(nèi)防御酶活性的測(cè)定結(jié)果表明，不同稀釋倍數(shù)對(duì)不同防御酶活性的影響存在一定差異，且整體以10～20 倍稀釋液提高谷子幼苗防御酶活性效果最好，說明菌株MY1 發(fā)酵液可提高谷子植株中的保護(hù)酶活性，從而提高植株的抗逆能力。仇艷肖[26]研究發(fā)現(xiàn)，拮抗菌ch2-22發(fā)酵液稀釋50～100 倍可明顯提高黃瓜幼苗體內(nèi)的防御酶活性；高振峰[27]研究發(fā)現(xiàn)，菌株ZSYB-1 發(fā)酵液稀釋10 倍后可明顯提高番茄體內(nèi)防御酶活性；戴秀華等[28]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌Lx-11發(fā)酵液稀釋100 倍后可明顯提高水稻體內(nèi)防御酶活性；張艷麗[23]研究發(fā)現(xiàn)，菌株LCO 和Th-17 菌懸液可提高谷子防御酶活性。本研究結(jié)果與上述報(bào)道結(jié)果存在一定的差異，可能與菌株來源不同以及菌株在提高互作植物防御酶活性方面存在一定差異有關(guān)。

另外，雖然谷子幼苗經(jīng)適當(dāng)稀釋后的MY1 菌株發(fā)酵液處理后其體內(nèi)的防御酶活性呈現(xiàn)出一定的提升效果，但對(duì)各防御酶提升效果進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，MY1 菌株發(fā)酵液對(duì)提高PAL 酶活性和降低體內(nèi)MDA 含量最為明顯，說明該菌株發(fā)酵液的抗病促生機(jī)制可能為提升PAL 酶活性和降低MDA含量。相關(guān)大田試驗(yàn)以及促生活性物質(zhì)的鑒定還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。