劉蓉芳，譚 雄，張 輝，毛湘屏，楊 柳，陳志成，毛以林△

(1. 江門市五邑中醫(yī)院，廣東 江門 529000； 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,長(zhǎng)沙 410005)

慢性心力衰竭(CHF)是心臟排血量絕對(duì)或相對(duì)不足，組織血流灌注不足及肺循環(huán)和(或)體循環(huán)瘀血為主要表現(xiàn)的一種疾病，其基本病理生理基礎(chǔ)是心臟重構(gòu)(cardiac remodeling,CR)，心肌細(xì)胞凋亡是其中1種。慢性心力衰竭(CHF)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，如腎上腺素、血管緊張素Ⅱ、氧化應(yīng)激、致炎細(xì)胞因子、缺血、壓力或容量負(fù)荷過(guò)重、缺氧等均可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是存在于真核生物中的非蛋白質(zhì)編碼RNA分子，主要通過(guò)與靶基因mRNAs3’非編碼區(qū)結(jié)合，降低mRNA分子的穩(wěn)定性，導(dǎo)致其降解或抑制靶mRNA轉(zhuǎn)錄后翻譯過(guò)程實(shí)現(xiàn)調(diào)控靶基因表達(dá)[3-4]，并可通過(guò)調(diào)控半胱胺酸天冬氨酸酶(caspases)家族蛋白表達(dá)，從而調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡[5]。微小RNA-1(microRNA-1，miRNA-1)和微小RNA-133(microRNA-133，miRNA-133)是肌肉組織特異性表達(dá)miRNA，在肌肉及心臟中具有重要作用，并均可通過(guò)調(diào)控半胱胺酸天冬氨酸酶(caspases)家族蛋白表達(dá)，從而調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡[5]。心康沖劑前期研究顯示，其對(duì)慢性心力衰竭具有抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)作用[6]，并下調(diào)心力衰竭大鼠下丘腦精氨酸加壓素(arginine vasopressin，AVP)mRNA及腎臟尿液水通道蛋白-2(aquaporin-2，AQP2)mRNA的表達(dá)，從而減少水鈉潴留[7-8]，改善心肌重構(gòu)[6]。本研究觀察心康沖劑調(diào)控慢性心力衰竭大鼠miRNA1、miRNA133/caspases基因表達(dá)作用，探討其抗心肌凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5周齡SPF級(jí)SD大鼠90只，購(gòu)于湖南斯克達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)43004700025096)，體質(zhì)量(150～180) g，雌雄各半。

1.2 藥品及儀器

注射用鹽酸阿霉素(深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字H44024359)；miRNA引物(上海生工合成)；caspase-3(美國(guó)CST，Rabbit，1∶1000，貨號(hào)#9662)；caspase-9(美國(guó)proteintech，Rabbit，1∶200，貨號(hào)10380-1-AP)；actin(美國(guó)proteintech，Mouse，1∶4000，貨號(hào)60008-1-Ig)；二抗HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(美國(guó)proteintech)；HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(美國(guó)proteintech)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT，上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)9027-67-2)；心康沖劑(湖南省中醫(yī)院中藥制劑室制備)；引物(上海生工合成)。Motic B5 顯微攝像圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪)；OLYMPUS BX43型雙目生物攝像顯微鏡(日本)；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)；便攜式彩色多普勒超聲儀(徐州大為DW-PF522)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及造模

動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)1周后隨機(jī)取10只作為正常組，余下大鼠行阿霉素造模，造模方法參考文獻(xiàn)[9]。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左心室短軸縮短率(LVFS)<30%[10]，即為心衰造模成功。80只模型成功大鼠再按隨機(jī)數(shù)字表法分為阿霉素模型對(duì)照組(模型組)、心康沖劑等效劑量組(低劑組)、心康沖劑2倍等效劑量組(中劑組)、心康沖劑4倍等效劑量組(高劑組)、芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)照組(對(duì)照組)各16只。

2.2 藥物制備及給藥

心康沖劑溶液配制：白參10 g，黃芪30 g，柴胡5 g，升麻5 g，桔梗5 g，茯苓15 g，薏苡仁30 g，生姜皮10 g，大腹皮10 g，陳皮10 g，桂枝6 g，制附片10 g，砂仁6 g。經(jīng)湖南省中醫(yī)院藥劑科制成干燥顆粒后，按成人等效劑量(低劑)、2倍等效劑量(中劑)、4倍等效劑量(高劑)配制成心康沖劑濃度分別為0.6 g/ml、1.2 g/ml、2.4 g/ml的溶液，對(duì)照組溶液按成人等效劑量配置成濃度為0.073 g/ml的芪藶強(qiáng)心膠囊溶液，大鼠給藥劑量按人和動(dòng)物體表面積折算[11]。灌胃量=給藥劑量/各組相應(yīng)溶液濃度，每次灌胃約1～2 ml。正常組、模型組給予等體積生理鹽水灌服，各組均每日1次,連續(xù)灌服8周，8周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束進(jìn)行取材。

2.3 指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.3.1 TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 打開(kāi)胸腔剪下心臟，去掉心房及右室，剪取心尖投入液化氮凍存，24 h后轉(zhuǎn)移至-80 ℃低溫冰箱。余下左心室投入10%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片，依次二甲苯透明、梯度乙醇脫水、PBS漂洗，50 μL TdT+450 μL熒光素標(biāo)記后反應(yīng)10 min。再加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液PBS漂洗，DAPI染色、封片。

2.3.2 Real-time PCR法檢測(cè)心肌組織miRNA-1、miRNA-133及caspase-3 mRNA、caspase-9mRNA表達(dá) 表1顯示，取出低溫冰箱凍存的大鼠左心室心尖部分1 g，Trizol法提取大鼠心臟組織總RNA，行RNA瓊脂糖凝膠電泳。取2 μg以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，42 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 min，冰上冷卻。以各檢測(cè)基因引物(引物序列如下)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。定量PCR擴(kuò)增條件，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。收集每循環(huán)第3個(gè)步驟熒光信號(hào)量，以2-ΔΔCt反映各樣品相對(duì)于對(duì)照組樣品目的基因的表達(dá)水平，-ΔΔCt=對(duì)照組ΔCt -各樣品ΔCt，△Ct=目的△Ct-內(nèi)參△Ct。每個(gè)樣本重復(fù)3次然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在網(wǎng)址http://www.mirbase.org/cgi-bin/query.pl?terms=214中搜索miRNA-1、miRNA-133序列，在NCBI上搜索caspase-3、caspase-9基因的序列，primer5軟件設(shè)計(jì)引物由上海生工合成。

2.3.3 Western blot 檢測(cè)心肌組織caspase-3、caspase-9蛋白含量 剪取凍存心肌組織0.25 g,加入200 μlRIPA裂解液蛋白裂解，4 ℃12000rpm離心15 min，取上清分裝離心管中；按照BCA蛋白定量試劑盒(Wellbio)使用說(shuō)明操作，測(cè)定蛋白濃度。然后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育，用1×TBST將一抗按照一定比例稀釋，caspase-3(1∶1000)，caspase-9(1∶200)，actin(1∶4000)，將膜與一抗一起孵育，4 ℃過(guò)夜。孵育結(jié)束，1×TBST洗3次，每次15 min，然后二抗孵育用1×TBST稀釋HRP標(biāo)記的二抗(Proteintech)，稀釋比例鼠抗(M)1∶4000，兔抗(R)1∶6000，將稀釋后的二抗與膜共同孵育45～60 min。孵育結(jié)束，1×TBST洗3次，每次15 min。最后顯色、曝光，使用ECL化學(xué)發(fā)光液(Thermo)與膜孵育3 min，用吸水紙吸盡液體，用保鮮膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內(nèi)與X膠片曝光數(shù)秒至數(shù)分鐘顯影沖洗。將曝光后的底片掃描，并用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 心康沖劑對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的作用

圖1顯示，直至藥物干預(yù)8周結(jié)束時(shí)，除正常組無(wú)死亡外，其余各組均有大鼠死亡，其中模型組、對(duì)照組、心康高劑量組分別5只，心康低、中劑量組分別3只。400×光鏡下，正常組心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色長(zhǎng)梭形，排列規(guī)整。與正常組比較，模型組心肌細(xì)胞棕褐色壞死顆粒物質(zhì)明顯增多；與模型組比較，心康低、中、高劑量組心肌細(xì)胞棕褐色壞死顆粒物質(zhì)明顯減少；與對(duì)照組比較，心康低、中劑量組心肌細(xì)胞凋亡相對(duì)較少。心康沖劑低、中劑量組心肌細(xì)胞藍(lán)色橢圓形細(xì)胞核與棕褐色顆粒物質(zhì)并見(jiàn)，2組凋亡顆粒無(wú)明顯差異。與心康低、中劑量組比較，心康高劑量組心肌細(xì)胞棕褐色壞死顆粒物質(zhì)較多。

圖1 TUNEL染色(心肌取材左心室橫切面，400×光鏡)

3.2 心康沖劑對(duì)心肌組織miRNA-1、miRNA-133及caspase-3 mRNA、caspase-9mRNA的作用

表2顯示，與正常組比較，模型組miRNA-1、caspase-3mRNA、caspase-9mRNA表達(dá)顯著增加，miRNA-133表達(dá)顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，心康低、中、高劑量3組miRNA-1、caspase-3mRNA、caspase-9mRNA表達(dá)顯著下降，miRNA-133顯著增加(P<0.05)；與對(duì)照組比較，心康高劑量miRNA-1、miRNA-133顯著減少，caspase-9mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與心康低劑量比較，心康沖劑高劑量miRNA-1、miRNA-133顯著減少，caspase-9mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與心康沖劑中劑量比較，心康沖劑高劑量miRNA-133顯著減少，caspase-9mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)。

表2 各組大鼠心肌組織miRNA-1、miRNA-133及caspase-3 mRNA、caspase-9mRNA表達(dá)比較

注：與正常組比較:*P<0.05；與模型組比較:△P<0.05；與對(duì)照組比較:▲P<0.05；與心康低劑量組比較:▼P<0.05；與心康中劑量組比較:#P<0.05

3.3 心康沖劑對(duì)心肌組織caspase-3、caspase-9的蛋白作用

表3圖2顯示，與正常組比較，模型組caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，心康沖劑低、中劑量組、對(duì)照組caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，心康高劑量組僅caspase-9蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)；與對(duì)照組比較，均無(wú)明顯差異；與心康沖劑低劑量比較，僅心康沖劑高劑量caspase-3(17,19KD)蛋白表達(dá)增多(P<0.05)；與心康沖劑中劑量比較，僅心康沖劑高劑量caspase-3(17,19KD)蛋白表達(dá)增多(P<0.05)。

表3 各組大鼠心肌組織caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)比較

注：與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與對(duì)照組比較：▲P<0.05；與心康低劑量組比較：▼P<0.05；與心康中劑量組比較：#P<0.05

圖2 Western blot法檢測(cè)大鼠心肌Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)比較

4 討論

微小RNA(microRNA)幾乎參與調(diào)控人類生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段[12]。MiRNA-1、miRNA-133是心肌中特異性表達(dá)并可能參與凋亡調(diào)節(jié)過(guò)程[13]，但二者作用可能相反，表現(xiàn)在miRNA-1促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]，而miRNA-133抑制心肌細(xì)胞凋亡[15]。Caspases是介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡外源性途徑和內(nèi)源性途徑的共同途徑，兩條通路最終都通過(guò)激活caspases介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡并參與慢性心衰的發(fā)生發(fā)展，其中caspase-9處于凋亡上游，當(dāng)被各種促凋亡因子激活后，對(duì)下游caspase產(chǎn)生作用，使其執(zhí)行凋亡程序。Caspase-3是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶[16],它的激活是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[17]，caspase-3是經(jīng)典凋亡通路后期的共同途徑。因此，下調(diào)caspase蛋白表達(dá)對(duì)于干預(yù)心室重構(gòu)乃至心力衰竭具有重要意義[18]。MiRNA在調(diào)控caspase機(jī)制研究上也表現(xiàn)出相反的作用機(jī)制，如miRNA-133可能是靶向抑制caspase-9的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡[19-20]，而miRNA-1通過(guò)正性調(diào)控caspase-3促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，心康沖劑干預(yù)后心肌凋亡減輕，尤其是心康沖劑低、中劑量組促凋亡分子miRNA-1、caspase-3及caspase-9的mRNA、蛋白表達(dá)顯著下降，抗凋亡分子miRNA-133表達(dá)增加，與既往研究證實(shí)的在抑制心肌細(xì)胞凋亡中miRNA-133靶向抑制caspase-9、促進(jìn)細(xì)胞凋亡中miRNA-1正性調(diào)控caspase-3的表達(dá)趨勢(shì)相同。與對(duì)照組比較，心康沖劑低、中劑量組調(diào)控miRNA-1、miRNA-133、caspase-3、caspase-9表達(dá)無(wú)明顯差異，但TUNNL染色仍顯示心康沖劑低、中劑量組心肌凋亡相對(duì)少，表明心康沖劑低、中劑量可能通過(guò)其他途徑增強(qiáng)抗心肌凋亡作用；與心康低、中劑量比較，心康沖劑高劑量在調(diào)控抗心肌凋亡基因和蛋白作用方面相對(duì)較弱。

慢性心衰早期主要以心氣、心陽(yáng)虧虛為主，中期為脾陽(yáng)受損，復(fù)加肺氣虧虛、水濕內(nèi)停，后期腎陽(yáng)虛衰，水飲泛濫。本實(shí)驗(yàn)研究表明，心康沖劑具有調(diào)控miRNA-1、miRNA-133/caspase-3、caspase-9抗心肌凋亡作用。MiRNA及其調(diào)控的靶基因在心血管疾病的病理過(guò)程中扮演著非常重要的角色，明確中藥對(duì)miRNA及其靶基因的調(diào)控，尋找慢性心衰的藥物治療新靶點(diǎn)，闡明中藥治療慢性重大疾病的科學(xué)性，有利于提高中藥在治療慢性重病中的地位。