陸婉杏， 蒙蘭青， 黃曉華

(1右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 廣西 百色 533000； 2廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 廣西 南寧 530001)

腦缺血性疾病嚴(yán)重影響著病人的生存質(zhì)量[1]，而腦缺氧缺糖導(dǎo)致的損傷是腦血管疾病的直接原因[2]。氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)損傷模型是一種通過剝奪細(xì)胞的營養(yǎng)來模擬腦缺血的經(jīng)典離體細(xì)胞模型。近年神經(jīng)細(xì)胞的OGD模型多被用于在細(xì)胞水平模擬臨床腦缺血過程，以進(jìn)行細(xì)胞自主修復(fù)及藥效機(jī)制方面的研究[3]。

阿利吉侖(aliskiren)不僅具有抗氧化應(yīng)激、減輕炎癥反應(yīng)、抗凋亡和減小梗死體積等多種功能，還可以改善神經(jīng)功能的缺失[4]。但目前有關(guān)阿利吉侖在神經(jīng)細(xì)胞OGD損傷中的保護(hù)作用研究極少，僅見苗江永[5]通過改良Longa線栓法建立腦缺血再灌注模型，因而有必要探討阿利吉侖對局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠的腦保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的某些生化、藥理和功能方面的特性與正常神經(jīng)元具有一定的相似性，故而被廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病及藥物作用機(jī)制方面的研究[6]。本實(shí)驗(yàn)以SH-SY5Y細(xì)胞為研究對象，建立OGD模型模擬腦缺血性損傷，分析阿利吉侖對氧糖剝奪SH-SY5Y細(xì)胞興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(excitatory amion acid transporter 2, EAAT2/GLT-1)、EAAT3/EAAC1、EAAT4、S100鈣結(jié)合蛋白β亞基(S100 calcium-bin-ding protein β subunit, S-100β)及內(nèi)皮素1(endothelin-1,ET-1)表達(dá)、乳酸(lactic acid,LD)水平、Na+-K+-ATPase活性及細(xì)胞形態(tài)的影響，探討阿利吉侖對OGD損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用，為腦缺血性疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為阿利吉侖作為有效腦保護(hù)劑的臨床應(yīng)用提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 主要藥品與試劑

阿利吉侖購自BioChemPartner；DMEM/F12培養(yǎng)基購自HyClone；胎牛血清購自Gibco；PBS、0.25%胰蛋白酶、CCK-8、 GLT-1 ELISA試劑盒、EAAC1 ELISA試劑盒、 EAAT4 ELISA試劑盒、ET-1 ELISA 試劑盒、S-100β ELISA試劑盒和Hoechst 33258購自Bioswamp;LD測試盒和超微量Na+-K+-ATP酶測試盒購自南京建成生物工程研究所。

2 主要儀器

酶標(biāo)儀購自Labsystems Multiskan MS;CO2恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo。

3 方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng) 神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫，復(fù)蘇后接種于含10%的胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的高糖DMEM中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化、400×g離心3 min、細(xì)胞重懸后，傳代，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2不同OGD處理時間對SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響 用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整SH-SY5Y細(xì)胞濃度后，種植于96孔板中，使每孔含3×103個細(xì)胞；OGD(37 ℃，1%O2，5%CO2)分別處理0 h、0.5 h、1 h、2 h及4 h；處理完畢后向每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；于酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處測量各孔的吸光度(A)值，細(xì)胞相對存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。本實(shí)驗(yàn)對照組細(xì)胞的存活率定為100%；以細(xì)胞相對存活率<60%的處理時間作為OGD造模時間[7]；結(jié)果篩選出OGD損傷時間為4 h，繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3不同劑量阿利吉侖對OGD處理的SH-SY5Y細(xì)胞的影響 取培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞，隨機(jī)分為5組，即對照(control)組，OGD組及阿利吉侖低、中、高劑量(5.0、10.0和20.0 μmol/L)組。除對照組外，OGD組和阿利吉侖組均進(jìn)行OGD造模。將對數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞以1×108/L接種到96孔板，正常培養(yǎng)24 h。OGD組換成無糖培養(yǎng)液，阿利吉侖低、中、高組換成含5.0、10.0和20.0 μmol/L阿利吉侖的無糖培養(yǎng)液，OGD(37℃，1%O2，5%CO2)處理4 h后，換正常培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。

3.4ELISA檢測SH-SY5Y細(xì)胞的GLT-1、EAAC1、EAAT4、ET-1和S-100β表達(dá) OGD處理4 h后，分別按照GLT-1、EAAC1、EAAT4、ET-1和S-100β ELISA試劑盒說明書檢測各實(shí)驗(yàn)組SH-SY5Y細(xì)胞的GLT-1、EAAC1、EAAT4、ET-1和S-100β表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.5Hoechst 33258染色觀察SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)變化 OGD處理4 h后，復(fù)氧24 h，棄培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定10 min，棄固定液，PBS洗兩遍，每次3 min，棄掉液體。加入少量Hoechst 33258染液，室溫染色3-5 min。棄掉染色液，用PBS洗5遍，每次3 min，棄掉液體。熒光顯微鏡檢測和拍照。

3.6LD測試盒和超微量Na+-K+-ATP酶測試盒檢測SH-SY5Y細(xì)胞的LD含量和Na+-K+-ATPase活性 OGD處理4 h后，取各孔上清，分別按LD測試盒和超微量Na+-K+-ATP酶測試盒說明書操作，在酶標(biāo)儀530 nm和636 nm下讀取各孔的A值，計算各組的平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。LD含量用mmol/(g protein)表示；Na+-K+-ATPase活性用U/(g protein)表示。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0對各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同OGD損傷時間對SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞相比，OGD損傷0.5 h、1 h、2 h和4 h的細(xì)胞A值逐漸降低(P<0.05)，即OGD損傷時間越長，SH-SY5Y細(xì)胞的活力越低，見圖1。OGD損傷4 h時，SH-SY5Y細(xì)胞的相對活力不足60%，因此4 h可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)OGD造模時間。

Figure 1.Effect of time after OGD injury on viability of SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group.

圖1 不同OGD損傷時間對SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

2 阿利吉侖對OGD損傷的SH-SY5Y細(xì)胞GLT-1、EAAC1、EAAT4、ET-1和S-100β表達(dá)的影響

ELISA檢測結(jié)果表明，與對照組相比，OGD組的GLT-1、EAAC1和EAAT4表達(dá)顯著減少(P<0.05)，ET-1和S-100β的表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與OGD組比較，阿利吉侖(5.0、10.0和20.0 μmol/L)組的GLT-1、EAAC1和EAAT4表達(dá)呈劑量依賴性增加(P<0.05)， ET-1和S-100β表達(dá)呈劑量依賴性減少(P<0.05)，圖2。

Figure 2.Effect of aliskiren on levels of GLT-1, EAAC1, EAAT4, ET-1 and S-100β in SH-SY5Y cells induced by OGD. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsOGD group.

圖2 阿利吉侖對OGD損傷的SH-SY5Y細(xì)胞GLT-1、EAAC1、EAAT4、ET-1和S-100β表達(dá)的影響

3 阿利吉侖對OGD損傷的SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響

Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，對照組的細(xì)胞核總體染色均勻，呈淡藍(lán)色；OGD損傷后，SH-SY5Y細(xì)胞核呈亮藍(lán)色，致密濃染，少數(shù)呈碎片狀；阿利吉侖(5.0、10.0和20.0 μmol/L)干預(yù)后，致密濃染的細(xì)胞核有所減少，形態(tài)趨于正常,見圖3。

Figure 3.Hoechst 33258 staining of SH-SY5Y cells in each group (×200).

圖3 各組SH-SY5Y細(xì)胞Hoechst 33258染色

4 阿利吉侖對OGD損傷的SH-SY5Y細(xì)胞乳酸含量和Na+-K+-ATPase活性的影響

與對照組相比，OGD組的乳酸含量顯著升高(P<0.05)，Na+-K+-ATPase活性顯著降低(P<0.05)；與OGD組相比，阿利吉侖(5.0、10.0和20.0 μmol/L)組的LD含量呈劑量依賴性降低(P<0.05)，Na+-K+-ATPase活性呈劑量依賴性升高(P<0.05)，見圖4。

討 論

許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病與神經(jīng)細(xì)胞的缺糖缺氧密切相關(guān)。腦細(xì)胞對葡萄糖和氧的依賴性都非常高，長期缺氧缺糖會導(dǎo)致腦細(xì)胞的不可逆性損傷，故而選擇合適的神經(jīng)細(xì)胞OGD損傷時間進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)類藥物的篩選尤為重要[8]。本研究采用CCK-8檢測OGD損傷不同時間后SH-SY5Y細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示OGD損傷時間越長，細(xì)胞活力越低；4 h時，細(xì)胞相對活力不足60%，因此，選擇4 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)OGD造模時間比較合適。因?yàn)榧?xì)胞活力太高時，后期阿利吉侖干預(yù)難以體現(xiàn)其對SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用；細(xì)胞活力太低時，阿利吉侖干預(yù)難以對OGD損傷的SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)。有研究也認(rèn)為，右美托咪啶對氧糖剝奪/再灌注誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用時，細(xì)胞活力接近50%的氧糖剝奪再灌注(OGD/R)造模時間比較合適[7]。

Figure 4.Effect of aliskiren on content of LD and activity of Na+-K+-ATPase in SH-SY5Y cells induced by OGD. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD group.

圖4 阿利吉侖對OGD損傷的SH-SY5Y細(xì)胞LD含量和Na+-K+-ATPase活性的影響

興奮性氨基酸毒性是腦缺血損傷的主要機(jī)制之一。谷氨酸的清除主要受興奮性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)節(jié)[9]。雖然GLT-1為膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體，但近年發(fā)現(xiàn)了僅在肽鏈 C端進(jìn)行改變的 GLT-1 剪切變異體，且GLT-1a、GLT-1b和GLT-1c主要分布于神經(jīng)元[10]；EAAC1和EAAT4均為神經(jīng)元轉(zhuǎn)運(yùn)體。EAATs和Na+-K+-ATPase是直接偶聯(lián)的，即兩者作為一個功能復(fù)合體調(diào)控谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。本實(shí)驗(yàn)ELISA結(jié)果表明，阿利吉侖能通過上調(diào)OGD損傷的SH-SY5Y細(xì)胞GLT-1、EAAC1和EAAT4表達(dá)水平，增強(qiáng)Na+-K+-ATPase活性，通過GLT-1、EAAC1和EAAT4及時將興奮性的谷氨酸從突觸間隙轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，終止興奮性突觸傳遞并維持細(xì)胞外谷氨酸的正常濃度，從而減輕細(xì)胞損傷。

ET-1是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中能產(chǎn)生廣泛病理、生理效應(yīng)的內(nèi)皮縮血管因子[12]。當(dāng)發(fā)生腦缺血缺氧時，ET-1的合成和釋放量會大幅提高，造成血管的劇烈收縮，導(dǎo)致嚴(yán)重的腦損傷。本實(shí)驗(yàn)中，阿利吉侖干預(yù)后各劑量組的ET-1水平均較OGD組顯著下降，這提示阿利吉侖可能是通過下調(diào)ET-1來減少OGD對SH-SY5Y細(xì)胞的損傷。

S-100β是一種酸性鈣結(jié)合蛋白，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長、分化和代謝，被認(rèn)為是反映腦膠質(zhì)細(xì)胞損傷的生化標(biāo)志性蛋白[13]。另外，星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元相互影響。EAATs 能夠促進(jìn)谷氨酸能突觸周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞快速釋放谷氨酰胺，被神經(jīng)元攝取用來合成谷氨酸和γ-氨基丁酸[14]。正常情況下的S-100β蛋白濃度很低，當(dāng)S-100β蛋白表達(dá)過量時，神經(jīng)元內(nèi)Ca2+水平上升，當(dāng)Ca2+超過神經(jīng)元的耐受閾時，會產(chǎn)生神經(jīng)毒性，造成神經(jīng)功能的嚴(yán)重?fù)p傷[15]。本實(shí)驗(yàn)ELIA檢測結(jié)果顯示，阿利吉侖組SH-SY5Y細(xì)胞的S-100β含量顯著低于OGD組，提示阿利吉侖可能是通過抑制S-100β的表達(dá)水平，阻止其介導(dǎo)的Ca2+濃度超載，從而保護(hù)OGD損傷的SH-SY5Y細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)中，OGD組SH-SY5Y細(xì)胞的LD含量顯著高于對照組，提示OGD損傷可以降低細(xì)胞利用氧的能力，細(xì)胞的能量代謝主要通過糖酵解獲得；細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-ATPase活性降低，表明細(xì)胞的能量代謝發(fā)生障礙。阿利吉侖干預(yù)后，細(xì)胞的LD含量顯著減少，Na+-K+-ATPase活性顯著增加，說明阿利吉侖可以減輕OGD損傷引起的細(xì)胞能量代謝障礙，增加細(xì)胞的能量供應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。這與秦文等[16]在研究N-乙酰半胱氨酸對氧糖剝奪大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用時得出的結(jié)論一致。本研究結(jié)果為阿利吉侖在臨床應(yīng)用及產(chǎn)品開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為防治腦缺血疾病的藥物開發(fā)提供了參考資料。