□ 宋曉婉 梁先龍 馮 娟 宋旭鳳 姚 凱 安徽中青檢驗檢測有限公司

1 前言

喹諾酮類藥物（quinolones）是人工合成的具有抗菌作用的一類藥物，因其無交叉耐藥性以及價格低廉等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)和動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。由于在預(yù)防和治療過程中喹諾酮類藥物的不規(guī)范使用，濫用及盲目改變使用劑量常有發(fā)生，影響到食物的食用安全，由此導(dǎo)致的食品安全問題備受關(guān)注[1-2]。據(jù)國內(nèi)現(xiàn)有的檢驗標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)報道，主要研究方法有液相色譜法[3]、液相色譜-質(zhì)譜法[4]，其中液相色譜-質(zhì)譜法作為主要研究方法[5,6]，解決了液相檢出限高、靈敏度低、基質(zhì)干擾嚴(yán)重等問題。但是，前處理方法也多采用固相萃取技術(shù)[7]，需要經(jīng)過凈化濃縮等步驟，成本較大、費(fèi)時費(fèi)力，靈敏度和重復(fù)性差，針對以上問題，本文在實驗過程中，研究的重點主要集中在待測物提取和凈化步驟的改進(jìn)，得到了具有低試劑消耗及高通量優(yōu)勢的QuECHERs方法，同時建立HPLC-MS/MS測定方法，此次研究取得的相應(yīng)進(jìn)展也將有助于殘留篩查，為喹諾酮類藥物的應(yīng)急檢測及風(fēng)險監(jiān)測提供技術(shù)支撐。

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

吡哌酸、依諾沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、西諾沙星、奧索利酸、萘啶酸與氟甲喹的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購自上海安譜科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸 均為色譜純，德國Merck公司；封端十八烷基（C18）粉末、N-丙基乙二胺（PSA）粉末，山東青云公司；無水硫酸鎂、氯化鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。1290-6470三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀，美國 Agilent 公司；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；超純水系統(tǒng)，四川優(yōu)普公司；G560E渦旋混勻器，上海佳能；MD200-1氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司；十萬分之一、萬分之一電子天平，德國賽多利斯公司。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的樣品2 g，置于50 mL離心管中，向樣品中加入混合外標(biāo)，禽畜肉及水產(chǎn)樣品中先加入2 mL水，渦旋使樣品分散均勻，然后向每個管中加入10 mL 5%的甲酸乙腈溶液，渦旋1 min，向各個管中加入萃取鹽（4 g MgSO4，1 g NaCl），渦旋振蕩3 min后，4 ℃下于高速冷凍離心機(jī)中以8 000 rpm的速度離心3 min。取上層乙腈層6 mL轉(zhuǎn)移至15 mL凈化管（含有50 mg PSA、150 mg C18、和900 mg MgSO4）中，渦旋2 min，以5 000 r/min的速度離心5 min，將全部上清液轉(zhuǎn)移至另一試管中，氮吹儀吹干，用1 mL初始流動相復(fù)溶，然后再用高速離心機(jī)以10 000 r/min的速度離心10 min，取上層溶液過0.22 μm有機(jī)相濾膜，上機(jī)。

2.2.2 色譜條件

2.2.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18，2.1 mm×50 mm，1.8 μm；柱溫：30℃，進(jìn)樣量：2 μL；流動相：A0.1%甲酸水；B乙腈。梯度洗脫，B流動相：0～1.0min 20%，1.0～4.0 min 25%，4～ 8.5 min：95%，8.5～12 min：10%。

2.2.2.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：ESI源，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），霧化氣電壓：40 psi，干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流速：11 L/min，鞘流氣溫度400 ℃，鞘流氣流速11 L/min；毛細(xì)管電壓：4 000 V。各喹諾酮類化合物的定量和定性離子、去簇電壓和碰撞能量各參數(shù)參考國家標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.3 實驗過程

用空白基質(zhì)配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以各個化合物濃度為橫坐標(biāo)，色譜圖峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的最低濃度點取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入陰性樣品中進(jìn)行加標(biāo)實驗，逐步調(diào)整各目標(biāo)化合物的加標(biāo)量，直到測出3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比時對應(yīng)的樣品濃度，分別計算對應(yīng)化合物的方法檢出限和定量限。分別取雞肉、雞蛋、魚肉的空白基質(zhì)，進(jìn)行批內(nèi)6平行，添加2.0、5.0、10.0 μg/kg 3個水平的15種喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2.1方法進(jìn)行添加回收實驗。

3 結(jié)果與討論

3.1 線性關(guān)系、檢出限、定量限和回收率

為降低基質(zhì)效應(yīng)影響，提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究采用了空白基質(zhì)提取液作為溶劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，結(jié)果表明15種喹諾酮類化合物在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性良好（R2≥0.995 3），該方法的檢出限在0.11～ 0.85 μg/kg，定量限在0.38～1.55 μg/kg，15種喹諾酮類藥物的色譜圖如圖1所示。

3.2 樣品的加標(biāo)回收率與精密度

取樣品，分別加入3個不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，實驗步驟按2.2進(jìn)行。每個添加水平重復(fù)測定6次，回收率在80.5%～112.8%，RSD為0.5%～12.0%。

3.3 實際樣品的測定結(jié)果

圖1 15 種喹諾酮類藥物的MRM色譜圖

隨機(jī)購買市售畜副產(chǎn)品、水產(chǎn)品100組，藥物殘留檢出率為15.4%，其中雞蛋中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的含量較低，均低于定量限，魚類產(chǎn)品檢出恩諾沙星、氧氟沙星，最大濃度分別為85.6 μg/kg和34.5 μg/kg，雞肉中主要檢出恩諾沙星，最大濃度45.6 μg/kg。結(jié)果數(shù)據(jù)分析表明目前畜副產(chǎn)品及水產(chǎn)品種的檢出值低于國家限值要求[8]，但也需要加強(qiáng)管理，規(guī)避風(fēng)險，保證食品安全。

4 結(jié)論

本實驗建立了同時測定動物源性食品中15種喹諾酮類藥物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法。禽畜肉及水產(chǎn)樣品中要首先加水進(jìn)行分散，然后采用含5%甲酸的乙腈提取，無水硫酸鎂-氯化鈉萃取，PSA和C18凈化。液相色譜采用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱，乙腈和0.1%甲酸水溶液作流動相進(jìn)行梯度洗脫。質(zhì)譜分析采用電噴霧多反應(yīng)監(jiān)測模式，采用基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。1種喹諾酮類藥物在各自的濃度范圍內(nèi)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.995 0，以雞肉、雞蛋、魚肉為代表性基質(zhì)進(jìn)行3水平加標(biāo)回收實驗，回收率為80.5%～112.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.5%～12.0%。本方法簡便快速，靈敏度和準(zhǔn)確性高，應(yīng)用于日常檢測可以縮短檢測周期，降低檢測成本，對于喹諾酮類藥物殘留檢測具有重要意義。