何旭君 趙 靜 賴增哲 羅晶晶 張華通③

(1廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院 廣東廣州510520;2廣州田園牧歌農(nóng)林有限公司 廣東增城511300)

菊 花 （Chrysanthemum×morifol iumRamat.）為菊科菊屬植物的干燥頭狀花序。具有疏風(fēng)散熱、清肝明目、解瘡毒的功效?，F(xiàn)代藥理試驗證明，菊花具有改善心血管功能、抗癌、抗菌、擴(kuò)血管、抗氧化等作用［1]。2015版《中國藥典—I部》中，菊花被收錄為藥食同源植物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值［2]。由于它可以在林間地頭、山坡地種植，近年來也成為一種重要的林下經(jīng)濟(jì)植物，被廣泛應(yīng)用?！侗静菥V目》中有“菊之品九百種”的記載，其中杭菊、亳菊、滁菊、懷菊最為有名，有“四大名菊”之稱?！龀敲劬铡菑V州田園牧歌農(nóng)林有限公司引種徽州亳菊，并從中選育出的良種。亳菊是菊花中的珍品，2014年被中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部登記為地理標(biāo)志性農(nóng)產(chǎn)品，亳菊疏風(fēng)散熱、解暑明目，多為春、夏兩季用藥，歷年來為中醫(yī)首選的菊花品種［3]。

菊花通常以嫁接、扦插、分株的方式進(jìn)行無性繁殖，長期的這種營養(yǎng)繁殖會使病毒積累，日趨嚴(yán)重，造成生長不良，品質(zhì)和產(chǎn)量也隨之下降，影響經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)國內(nèi)外報道，侵染菊花的病毒多達(dá)20多種，其中菊花B病毒（Chrysanthemum virus B，CVB）和番茄不孕病毒（Tomatoaspermy virus，TAV）為侵染、危害菊花的優(yōu)勢病毒［4-5]，受感染的植株表現(xiàn)為矮小，花朵畸形、褪色、變小，甚至皺縮、扭曲、枯斑、壞死等，嚴(yán)重地減少了菊花的產(chǎn)量、降低了菊花的品質(zhì)?！龀敲劬铡谠耘喾N植的過程中，也表現(xiàn)出這兩種病毒侵染的癥狀，花朵變小或花形殘缺等，極大地影響了產(chǎn)量和品質(zhì)。為了良種的推廣和應(yīng)用，勢必要對種苗進(jìn)行脫毒，獲取脫毒苗。

目前，植物脫毒的方法主要有莖尖培養(yǎng)脫毒法、熱處理脫毒法、化學(xué)脫毒法等［6]。這些脫毒方法各有利弊，在菊花無毒苗生產(chǎn)中都有應(yīng)用［7-9]。為獲得‘增城蜜菊’的脫毒苗，本研究利用‘增城蜜菊’組培苗為材料，進(jìn)行微莖尖組培脫毒，總結(jié)出一套菊花組織培養(yǎng)微莖尖脫毒技術(shù)，以利于‘增城蜜菊’的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

以‘增城蜜菊’的組培苗作為莖尖脫毒材料。

1.2 方法

1.2.1 組培苗的獲得

以廣州田園牧歌農(nóng)林有限公司選取出的‘增城蜜菊’優(yōu)株而表現(xiàn)輕微帶毒病征的植株，采其頂芽為外植體，用0.1%的HgCl2溶液表面消毒7 min，無菌水沖洗5次。將消毒好的材料切成約1.5 cm長的小段（帶有1～2個腋芽）接種到MS＋6-BA 1.0 mg/L＋蔗糖30 g/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)形成的芽轉(zhuǎn)入MS＋NAA 0.1mg/L＋蔗糖30 g/L培養(yǎng)無菌組培苗。

1.2.2 莖尖切取

在超凈工作臺內(nèi)，選取健壯組培苗，將苗取出放在已消毒品的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下進(jìn)行莖尖剝離，直到出現(xiàn)圓滑生長點時，用滅過菌的解剖刀分別切取0.5、1.0、1.5、2.0mm莖尖，每處理分別切取50個莖尖，接種于微莖尖不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)成功的不定芽繼續(xù)轉(zhuǎn)到MS＋6-BA 2.0mg/L＋蔗糖30 g/L進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，統(tǒng)計莖尖成活率。重復(fù)3次試驗。

1.2.3 微莖尖誘導(dǎo)

以MS為基本培養(yǎng)基，采用兩種莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，JH7：MS＋6-BA 0.1mg/L＋椰子汁100mL/L＋蔗糖30 g/L，JH6：MS＋6-BA0.1mg/L＋蔗糖30 g/L。將不同長度莖尖分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基JH7和JH6兩種培養(yǎng)基后，放入培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定芽，統(tǒng)計莖尖誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)成功的不定芽繼續(xù)轉(zhuǎn)到MS＋6-BA 2.0mg/L＋蔗糖30 g/L進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽叢。將芽叢單芽切下接種到生根培養(yǎng)基MS＋NAA 0.1mg/L＋蔗糖30 g/L，獲得完整的植株。培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，光照2 500～3 000 lx。

1.2.4 脫毒苗檢測

根據(jù)NCBI GenBank（The Nat ional Center for Biotechnology Information）中收錄的菊花B病毒（CVB）和番茄不孕病毒（TAV）的基因序列，應(yīng)用Primer premier5.0軟件，分別設(shè)計相應(yīng)引物，NCBI Primer BLAST在線設(shè)計引物。根據(jù)已有的菊花CVB、TAV病毒的基因序列各設(shè)計一對引物，CVB-F：ggcagaagaagcgaacccta；CVB-R：ccct t tggggtct tggtagc，擴(kuò)增產(chǎn)物385 bp和TAV-F：catcctccccgt tggaaaga； TAV-R： aacaagctcgggtcacctac，擴(kuò)增產(chǎn)物408 bp，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。使用Invit rogen公司Trizol試劑盒，按其使用指導(dǎo)書提取總RNA。使用 TransScript?Al l-in-One First-St rand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒合成cDNA，Taq酶，10×EXTaq Buf fer，2.5 each dNTP均購自Takara。PCR反應(yīng)在20μL體系中進(jìn)行：10×EX Taq Buf fer 2μL，2.5 each dNTP 1.6μL，前后引物各0.6μL，無菌水14.58μL，EX Taq酶0.12 μL，cDNA 0.5μL，加完樣后混勻后于PE 9600擴(kuò)增儀上完成如下的PCR循環(huán)反應(yīng)：94℃2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s； 72℃ 45 s， 94℃ 30 s ，60℃30 s；72℃45 s循環(huán)30次；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫毒單株的誘導(dǎo)

在體視顯微鏡下切下幼小的微莖尖（頂端生長錐）接種入培養(yǎng)基，微莖尖能夠較快的適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長約1周左右就開始生長膨大（圖1-A）。隨著，莖尖繼續(xù)生長，葉長出形成芽苗，40 d左右可長高達(dá)2～3 cm（圖1-B），觀察其誘導(dǎo)率。把形成的芽苗轉(zhuǎn)入?yún)惭空T導(dǎo)培養(yǎng)基，經(jīng)25 d左右培養(yǎng)，即可誘導(dǎo)形成叢芽（圖1-C），此時，采樣進(jìn)行脫毒效果檢測。如果將芽叢單芽切下接種到生根培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)，7 d左右開始生根，20～25 d左右就可以得到完整的植株（圖1-D）。

2.2 培養(yǎng)基類型和莖尖大小對微莖尖誘導(dǎo)的影響

將獲取的不同長度莖尖分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基JH7和JH6培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)40 d后記錄存活的莖尖數(shù)和生長表現(xiàn)情況。如表1所示，采用JH7培養(yǎng)基的微莖尖平均存活數(shù)在26.33～43.67，平均誘導(dǎo)率都在50%以上，最高達(dá)到了87.33%，誘導(dǎo)效果較好，誘導(dǎo)成功的微莖尖大部分出現(xiàn)綠色小點，開始萌發(fā)。而采用JH6培養(yǎng)基的微莖尖，存活數(shù)在13.00～36.33，平均誘導(dǎo)率從26.00%到72.67%。方差分析表明，JH7培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果顯著高于JH6，表明在培養(yǎng)基中加入椰子汁，可以顯著的提高‘增城蜜菊’微莖尖的存活數(shù)和誘導(dǎo)率。

圖1‘增城蜜菊’微莖尖生長成苗過程

微莖尖的大小顯著影響了其存活數(shù)和誘導(dǎo)率。如表1所示，在JH7、JH6培養(yǎng)基上都有著相同的趨勢，隨著所取莖尖的長度的增加，平均存活數(shù)和平均誘導(dǎo)率都在顯著增加。在JH7和JH6培養(yǎng)基中，取2.0mm莖尖時的平均誘導(dǎo)率是取0.5mm莖尖時的1.66倍和2.79倍，表明所取的莖尖越大越有利于莖尖的存活和誘導(dǎo)。

表1 培養(yǎng)基類型和莖尖大小對微莖尖誘導(dǎo)的影響

2.3 脫毒苗的病毒檢測

隨機選取2株‘增城蜜菊’的母株進(jìn)行TAV和CVB病毒檢測，結(jié)果這兩株植株里都帶有TAV和CVB病毒圖2。

對不同大小的微莖尖誘導(dǎo)成的苗，進(jìn)行RTPCR病毒檢測，發(fā)現(xiàn)當(dāng)莖尖大小為1.0、1.5、2.0 mm時，所獲得植物，脫毒情況不穩(wěn)定，有時能檢測出其中一種病毒，有時甚至兩種病毒都能夠檢測到，脫毒不徹底，但當(dāng)切取的莖尖為0.5mm時，所獲得植株的TAV和CVB病毒檢測都為陰性（圖3），表明要想獲得穩(wěn)定的‘增城蜜菊’脫毒苗，切取0.5 mm的莖尖誘導(dǎo)成苗的脫毒效果好，且穩(wěn)定。

圖2 ‘增城蜜菊’母株的病毒檢測

3 討論與結(jié)論

目前，國內(nèi)外報道能侵染菊花的病毒多達(dá)20多種，病毒特點不同，脫除的難易程度也不同［4-5]。在這些侵染菊花的病毒中CVB和TAV病毒對菊花侵染高、危害嚴(yán)重。如VERMA等［11]利用DAS-ELISA對生長在印度喜馬偕爾省的菊花進(jìn)行CVB病毒檢測，發(fā)現(xiàn)其侵染率最高可以達(dá)到94.6%。而MEIJU等［12]對臺灣9個地區(qū)采集的504菊花樣品進(jìn)行CVB病毒檢測，發(fā)現(xiàn)CVB病毒感染率高達(dá)78%左右。而在福建省的菊花中，TAV病毒侵染率達(dá)到了85.9%，造成花朵畸形、褪色、變小，甚至皺縮、扭曲、壞死等，對菊花的生產(chǎn)、銷售帶來很大威脅［13]?！龀敲劬铡峭ㄟ^選育出來的新品種，在林間地、山坡地種植具有較強的優(yōu)勢，能充分利用林地，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，同時給林農(nóng)增加收入?！龀敲劬铡谠耘噙^程中表現(xiàn)出了CVB和TAV病毒侵染的表型，影響了產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，通過RT-PCR鑒定，在母株中發(fā)現(xiàn)這2種病毒的存在（圖2）。利用植物組培技術(shù)，獲取脫毒苗是保障種苗質(zhì)量，有利于品種的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

獲得脫毒種苗的方法有莖尖脫毒法、化學(xué)處理法、熱處理法等。莖尖脫毒利用的是病毒在植物體內(nèi)分布的不均勻性，在植物生長點或生長點附近無病毒或病毒濃度很低的特點，切取不帶毒的生長點培養(yǎng)成苗［14-15]。一般認(rèn)為，在生產(chǎn)應(yīng)用中進(jìn)行脫除病毒時，剝?nèi)〉那o尖越小，其脫毒效果越好。報道表明，在莖尖為0.1～0.2mm時，脫毒率可達(dá)到100%［16]。趙蘭勇等［16]做到采用0.3～0.5 mm的莖尖時，脫毒率可達(dá)到78.5%～88.5%，這高于本實驗的脫毒率（約60%）。但是隨著莖尖增大，在莖尖為1.0mm時，該研究表明已經(jīng)完全脫毒失?。?6]。但在本實驗中，即使2.0mm的莖尖，也可達(dá)到約40%的脫毒率。眾所周知，隨著剝離莖尖的縮小，成活率就會相應(yīng)降低，剝?nèi)〉牟僮麟y度也大會幅度增加，與本研究相符合（表1）。因此，本試驗結(jié)果通過增大莖尖而提高了莖尖脫毒操作及成活率，為菊花的莖尖脫毒提供了重要的參考。

化學(xué)藥劑用于病毒的脫除，主要是利用了化學(xué)物質(zhì)對植物病毒有體外鈍化作用，或者在活體內(nèi)有抑制病毒及治療作用，或者可以誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生與病毒相關(guān)的蛋白，從而提高植株的抗病性［17]?；瘜W(xué)藥劑在實際應(yīng)用中不同植物會有不同程度的藥害，需要做前期的摸索，弄清化學(xué)藥劑的使?jié)舛群吞幚頃r間，如比較廣泛應(yīng)用的病毒唑在使用時就要小心［18]。藥劑處理操作簡單，脫毒效率較高，但是處理時間比較長，不同的病毒種類對不同種類的藥劑反應(yīng)不同。熱處理法脫毒是利用病毒和寄主植物對高溫忍耐性的不一樣，將帶病毒的植物組織處于高于正常溫度的適當(dāng)高溫環(huán)境，寄主植物組織很少或不會受到傷害，而這種溫度可部分或完全鈍化植物組織中的病毒，從而達(dá)到去除病毒的目的［19-20]。

熱處理只對那些球狀的病毒或線狀的病毒有效果，而對桿狀病毒不起作用［21]，對于一些耐熱的病毒，這種方法也不適合。這些脫毒方法在菊花脫毒苗的獲得中都有研究者用，由于每個方法各有優(yōu)缺點，也有研究者將其中兩種方法結(jié)合起來應(yīng)用［22-24]。趙霜等［22]比較了不同方法脫除“墨菊”體內(nèi)CVB、黃瓜花葉病毒（C M V）及煙草花葉病毒（T M V）的效果，結(jié)果表明直接剝莖尖操作簡單，但脫毒效果不強；病毒唑結(jié)合莖尖培養(yǎng)法，其脫毒效果雖較前者強，但對植物存在一定的藥害作用；熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)法的脫毒效果最強，但是熱處理持續(xù)的時間較長且需要一定的儀器設(shè)備，繁殖一批脫毒苗的周期相對較長。在幾個處理中熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)法的效果最好，但這種方法對不同病毒的脫毒效果有差異，生產(chǎn)上要根據(jù)病毒自身的性質(zhì)選擇適宜的脫毒方法。

本研究中以組培苗為材料，直接切取無菌的莖尖作為外植體進(jìn)行脫毒，結(jié)果表明污染少，成苗率高。在JH7的培養(yǎng)基中，即使莖尖切取到0.5 mm時，誘導(dǎo)率仍能達(dá)到52.67%，脫毒率為100%（表1，圖3），能大大滿足生產(chǎn)的需要。趙蘭勇等［16]切取0.3～0.5 mm的莖尖時，脫毒率達(dá)到78.5%～88.5%，低于本實驗。同時，這樣也避免了使用2種方法結(jié)合起來，才能達(dá)脫毒的繁瑣。因此，在實踐中，需要進(jìn)一步研究不同品種最佳脫毒效果的相關(guān)條件和在生產(chǎn)中采用受市場青睞又容易脫毒的優(yōu)良品種。

莖尖的誘導(dǎo)成功是莖尖脫毒成功的關(guān)鍵步驟。本研究還分析了椰子汁對‘增城蜜菊’莖尖的誘導(dǎo)的促進(jìn)作用。由于椰子汁等天然有機物汁液含有氨基酸、植物激素、酶、微量元素等物質(zhì)而營養(yǎng)豐富，在培養(yǎng)基內(nèi)加入這些天然有機物能夠增強培養(yǎng)物的增殖與分化效應(yīng)，促進(jìn)培養(yǎng)物更快更好地生長發(fā)育［25]。胡燕梅等［26]研究發(fā)現(xiàn)，椰子汁等5種天然有機物的添加有利于大花蕙蘭類原球莖的增殖與分化。而在貢菊的培養(yǎng)基中加入椰子汁可以顯著的促進(jìn)貢菊組培苗的壯苗生長［27]。甜葉菊組培時，在培養(yǎng)基中添加椰子汁能促進(jìn)試管苗的增殖［28]。本研究中，在莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加椰子汁，對不同長短莖尖的誘導(dǎo)都有促進(jìn)作用（表1），進(jìn)一步證明了椰子汁對組織培養(yǎng)的增殖和分化作用。但是由于生產(chǎn)天然有機物的成分及本身的濃度具有不穩(wěn)定性，受到來源植物產(chǎn)地、品種、季節(jié)、株齡、氣候、栽培條件等多種因素的影響，以致其有利于培養(yǎng)物生長和分化的成分不穩(wěn)定，在具體使用時需要做前期的探索研究。

本研究采用的脫毒路徑是先用帶毒材料建立起無菌繁殖體系后，再用建立起的無菌繁殖體系的頂芽切取微莖尖體進(jìn)行脫毒，雖增加了脫毒的操作工序，但這條路徑比傳統(tǒng)的外植體消毒后直接剝離微莖尖的路徑，顯示脫毒切取的莖尖可以更長，技術(shù)難度更低，而成功率比較高。我們的實驗研究表明，切取2.0mm的莖尖，也可達(dá)到大約40%脫毒率（表1），而趙蘭勇等［16]在切取莖尖為1.0mm及以上時的脫毒已失敗了。因此，本實驗采用的微莖尖脫毒技術(shù)操作方法具有一定的生產(chǎn)實踐意義。