吳磊 羅華倫 張依裕 覃媛鈺 向程舉 吳學(xué)樹

摘要：為進(jìn)一步了解長順綠殼蛋雞FGF23基因的遺傳效應(yīng)，試驗(yàn)隨機(jī)抽取同日出雛、健康無病、同等管理?xiàng)l件下飼喂10周齡的100只長順綠殼蛋雞，翅靜脈采血，提取DNA，采用混合基因池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合直接測序法對FGF23基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）篩查。結(jié)果表明，在長順綠殼蛋雞FGF23基因啟動子區(qū)共篩查到3個(gè)SNP突變位點(diǎn)（g.73424388，T>C;g.73424577，TC），其中，g.73424388和g.73424660兩個(gè)突變位點(diǎn)呈中度多態(tài)，g.73424577呈低度多態(tài)，說明長順綠殼蛋雞在自然群體中的遺傳多樣性較為豐富。

關(guān)鍵詞：長順綠殼蛋雞;FGF23基因;單核苷酸多態(tài)性;抗逆性

中圖分類號：S831.2? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）16-0107-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.16.024? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： To further understand the genetic effects of the FGF23 gene in Changshun green shell，100 random long-green hens fed with 10 weeks old were randomly selected from the same time， healthy and disease-free， under the same management conditions. Blood was collected from the wing veins， DNA was extracted， and PCR was performed using a mixed gene pool. Direct sequencing method was used to study the single nucleotide polymorphism（SNP） screening of FGF23 gene. Results showed that three SNP mutation sites were screened in the promoter region of FGF23 gene in Changshun green shell（g.73424388，T>C;g.73424577，TC） Among them， g.73424388 and g.73424660 two mutation sites are moderate polypeptides， and g.73424577 is a low polypeptide. It showed that the genetic diversity of Changshun green shell hens is abundant in natural populations.

Key words： Changshun green shell hen; FGF23 gene; single nucleotide polymorphism; resistance

成纖維細(xì)胞生長因子（Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF），又稱肝素結(jié)合生長因子（Heparin binding growth factor），是一類具有廣泛生物學(xué)活性的肽類物質(zhì)，是多能信號分子，具有參與細(xì)胞增殖、分化和游走等功能[1]。截至目前，成纖維細(xì)胞生長因子共鑒定出23種，包括人類和鼠的FGF（人類FGF15和鼠FGF19尚未被相關(guān)研究證實(shí)），這23種成纖維細(xì)胞生長因子（FGF1～FGF23）均屬于FGF家族成員。成纖維細(xì)胞生長因子家族中的這些成員參與調(diào)節(jié)眾多生長發(fā)育過程，特別是在細(xì)胞保護(hù)、血管再生及促有絲分裂領(lǐng)域已得到開發(fā)與應(yīng)用，根據(jù)其系統(tǒng)發(fā)育以及同源性的不同，還可以將FGF分為多個(gè)亞家族[2]。FGF存在于脊椎動物和無脊椎動物體內(nèi)，其含有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，這是FGF家族因子的典型特征[3]。FGF23由成骨細(xì)胞等腎外組織合成和分泌，對機(jī)體內(nèi)很多腺體及器官，如胸腺、甲狀腺、甲狀旁腺及心臟、肝臟等都有作用[4]。本研究通過篩查長順綠殼蛋雞FGF23基因啟動子區(qū)多態(tài)性、計(jì)算其等位基因頻率和PIC并進(jìn)行分析等工作，結(jié)合FGF23及其基因多態(tài)性在人體內(nèi)對骨骼發(fā)育、血磷穩(wěn)定等的影響，從而推測其在家禽體內(nèi)的作用，為進(jìn)一步了解家禽機(jī)體血磷穩(wěn)定、保障家禽機(jī)體健康、家禽選種育種提供參考，對促進(jìn)家禽業(yè)的良好發(fā)展具有重要的意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗(yàn)動物? 長順綠殼蛋雞隨機(jī)采樣于貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院農(nóng)場（100只：♂50，♀50），采樣方法為翅靜脈采血，每只采血1.0～1.5 mL，保存于普通生化管內(nèi)（無抗凝劑條件下）靜置斜放，用移液槍把析出的血清轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)離心直至樣品清澈透亮，樣品放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2? 主要試劑? 全血DNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司;2×Taq PCR Master Mix試劑和瓊脂糖購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;DM2000 購自重慶擎科生物科技有限公司。

1.1.3? 主要儀器? 電泳儀（DYY-2C），北京市六一儀器廠;化學(xué)發(fā)光熒光全自動分析成像儀（Biosens SC710），上海山富科學(xué)儀器有限公司;梯度PCR儀（PTC200），美國Bio-Rad公司;電子天平（BL-320H），日本津島公司;高壓滅菌鍋（HRLM-80），中國海爾集團(tuán)。

1.2? 方法

1.2.1? 基因組DNA的提取? 全血基因組DNA的提取方法，參照天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒（DP304）內(nèi)所附的操作說明書，在實(shí)際操作中可以根據(jù)具體情況稍作修改（如適當(dāng)延長離心次數(shù)和離心時(shí)間、適當(dāng)增加或減少操作步驟中試劑的用量），但要保證所提DNA的質(zhì)量。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，NANODROP 2000 DNA濃度測定儀（美國Thermo Scientific公司）測定濃度。

1.2.2? 引物合成及目的片段擴(kuò)增? 根據(jù)雞基因mRNA序列（GenBank登錄號：NC_006088.4）設(shè)計(jì)1對引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：1 μL基因組DNA模板，上游引物和下游引物各1 μL，10 μL 2×Es Taq Master Mix，7 μL RNase-Free Water，總體積為20 μL，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性50 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。待反應(yīng)結(jié)束后，將PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3? SNP篩查和統(tǒng)計(jì)分析? 利用相關(guān)的生物信息學(xué)分析軟件，如DNA STAR、MW snap等對FGF23基因測序結(jié)果進(jìn)行SNP篩查，尋找突變位點(diǎn)并計(jì)算等位基因頻率。參照李萬貴等[5]、潘蘭兵[6]的方法，運(yùn)用DNA STAR等生物軟件進(jìn)行序列拼接、比對、篩查多態(tài)位點(diǎn);統(tǒng)計(jì)各等位基因頻率、基因型頻率。利用SPSS軟件處理分析，并計(jì)算位點(diǎn)純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）等。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 基因組DNA提取檢測結(jié)果

按照試劑盒內(nèi)操作提取3個(gè)雞品種所有個(gè)體的全血基因組DNA，其完整性通過1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。由圖1可以看出，所提的DNA完整性較好，經(jīng)熒光全自動分析成像儀及DNA濃度檢測儀檢測。結(jié)果表明，OD260 nm/OD280 nm的比值為1.8～2.0，DNA純度較高，可用于下一步試驗(yàn)。

將提取所得的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，經(jīng)過PCR擴(kuò)增所獲得的目標(biāo)片段呈現(xiàn)單一、明亮的條帶，且PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期片段大小相符，檢測結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可用于下一步試驗(yàn)研究。

2.2? FGF23基因SNP（單核苷酸多態(tài)性）篩查

通過DNA混合池結(jié)合直接測序的方法，運(yùn)用DNA STAR等軟件進(jìn)行分析后，在雞FGF23基因的啟動子（73424155～73425413）區(qū)域共檢測到3個(gè)SNP位點(diǎn)。每個(gè)突變位點(diǎn)上的堿基突變?yōu)榈趃.73424388位堿基發(fā)生（T>C）突變、第g.73424577位堿基發(fā)生（T

2.3? FGF23基因啟動子區(qū)SNP部分遺傳特性分析

通過對3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)后所得出的結(jié)果見表2。由表2可知，長順綠殼蛋雞FGF23基因啟動子區(qū)g.73424388位點(diǎn)上發(fā)生T/C突變，等位基因頻率分別為0.443和0.567，位點(diǎn)雜合度（He）為0.491，雜合性較高;多態(tài)信息含量（PIC）為0.370 4，屬于中度多態(tài);在g.73424577位點(diǎn)發(fā)生T/C突變，等位基因頻率分別為0.950和0.050，位點(diǎn)雜合度（He）為0.095，雜合性較低;PIC為0.090 5，屬于低度多態(tài);在g.73424660位點(diǎn)發(fā)生C/G突變，等位基因頻率分別為0.443和0.567，位點(diǎn)雜合度（He）為0.491;PIC為0.370 4，屬于中度多態(tài)。3個(gè)突變位點(diǎn)有效等位基因數(shù)（Ne）分別為1.965、1.105和1.965，群體分布較均勻。

3? 討論

目前，有關(guān)FGF23基因在家禽方面的研究報(bào)道十分少見，對于FGF23及其基因的絕大部分研究為其與人體的機(jī)體發(fā)育、新陳代謝、人類健康和疾病之間的相關(guān)性[5]，也有一些該基因在實(shí)驗(yàn)動物（如鼠）體內(nèi)進(jìn)行相關(guān)研究的文獻(xiàn)和報(bào)道。本研究以長順綠殼蛋雞為試驗(yàn)材料，首次在FGF23基因啟動73424155～73425413區(qū)域共檢測到3個(gè)SNPs位點(diǎn)，第g.73424388位堿基發(fā)生（T>C）突變、第g.73424577位堿基發(fā)生（T

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