趙瑞華， 賀曉龍， 劉月芹， 孫常青

(1.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 延安 716000； 2.陜西省紅棗重點實驗室， 陜西 延安 716000； 3.陜西瑞福興生物科技有限公司， 陜西 渭南 714000)

海鮮菇〔Hypsizygusmarmoreus(Peck) H. E. Bigelow〕又名玉蕈和蟹味菇，屬擔(dān)子菌門層菌綱傘菌目白蘑科玉蕈屬，形態(tài)美觀，味道鮮美獨特，質(zhì)地脆嫩，常被稱為“假松茸”[1-2]，是一種高蛋白、低脂肪、富含多種礦物質(zhì)和維生素的保健食品，具有平衡膳食，提高免疫力，延年益壽的功效[3-9]。海鮮菇是我國重要的食藥用真菌資源，深受消費者喜愛，產(chǎn)量正逐年提高。但由于生產(chǎn)周期較長，生長速度較慢，抑制雜菌的能力較差，尤其在工廠化生產(chǎn)的任何時期均可能發(fā)生雜菌(細(xì)菌和霉菌)污染，特別是菌絲生長階段最易受雜菌污染，因此嚴(yán)重影響海鮮菇的產(chǎn)量與品質(zhì)，造成巨大經(jīng)濟損失的同時嚴(yán)重影響和阻礙海鮮菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[10-17]。加之培養(yǎng)基營養(yǎng)水分充足，如果滅菌不徹底更有利于細(xì)菌的生長增殖[18]。食用菌被細(xì)菌感染后仍然可以生長，但由于營養(yǎng)物質(zhì)的流失導(dǎo)致生長緩慢，嚴(yán)重時可導(dǎo)致培養(yǎng)基腐敗、有酸臭味，徹底無法生長從而致使栽種失敗[19-20]。目前，食用菌栽培污染研究大多是關(guān)于霉菌方面的報道，關(guān)于海鮮菇工廠化生產(chǎn)污染細(xì)菌的研究鮮見報道[21]。鑒于此，筆者對海鮮菇工廠化生產(chǎn)菌包常見細(xì)菌病害進行調(diào)查，分離純化病原菌株，采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)手段對污染細(xì)菌進行鑒定，并在此基礎(chǔ)上探討常用抑菌藥劑對細(xì)菌的防治作用，以期為海鮮菇工廠化生產(chǎn)細(xì)菌病害的綜合防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 海鮮菇菌包 海鮮菇菌包由陜西瑞福興生物科技有限公司提供，隨機采集污染菌包，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基均為自制。1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏1.5 g，蛋白胨2.5 g，NaCl 2.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容1 000 mL，pH 7.2。2) 休和利夫森二氏培養(yǎng)基：蛋白胨2 g，NaCl 5 g，K2HPO40.2 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1 000 mL，1%溴麝香草酚藍水溶液3 mL，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.4。3) 葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，K2HPO45 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.4，每管分裝4～5 mL。4) PDA培養(yǎng)基：去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，2%瓊脂，加蒸餾水定容至1 000 mL。

1.1.3 試劑 二氧化氯消毒劑，夏縣瑤臺生物科技有限公司；40%克霉靈可濕性粉劑，湖北隨緣食用菌消毒劑有限公司；二氯異氰尿酸鈉消毒劑，威島生物公司；50%多菌靈可濕性粉劑，運城市應(yīng)用化學(xué)廠；新潔爾滅，德州德新康消毒制品有限公司。

1.1.4 儀器設(shè)備 VD-650超凈工作臺，上海力辰儀器科技有限公司；HAD-303A-4恒溫培養(yǎng)箱，北京恒奧德儀器儀表有限公司；MiniAmp PCR儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DM500雙目生物顯微鏡，沈陽利昂科技有限公司；CLG全自動高壓滅菌鍋，致微廈門儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預(yù)處理

1) 樣品采集。試驗用污染菌包于2017年2—4月分3批隨機取自陜西省瑞福興生物科技有限公司的發(fā)菌室，被雜菌污染的菌包外觀可見明顯的病變癥狀(圖1)。

注：1～4，受污染的海鮮菇菌包；5，正常的海鮮菇菌包。

Note: 1～4，contaminatedH.marmoreusfungus packs；5，normalH.marmoreusfungus pack.

圖1海鮮菇受污染的菌包樣品

Fig.1 Samples of contaminatedH.marmoreusfungus packs

2) 抗菌藥劑PDA平板制備。將二氧化氯消毒液、二氯異氰尿酸鈉、克霉靈、多菌靈和新潔爾滅溶液稀釋成50 mg/mL、100 mg/mL和200 mg/mL后，分別將其與PDA培養(yǎng)基混勻，制成終濃度分別為50 mg/mL、100 mg/mL和200 mg/mL的PDA平板備用，以不添加抑菌劑的PDA平板為對照。

1.2.2 污染細(xì)菌的分離與鑒定

1) 分離純化。對污染菌包表面殺菌消毒，切開菌包的發(fā)病部位，取污染菌料放入裝有滅菌雙蒸水的試管中，震蕩形成懸濁液，依次稀釋成10倍、100倍和1 000倍等不同濃度后，取適量接種到牛肉膏蛋白胨平板上，37℃培養(yǎng)12 h后，觀察平板上菌落的生長情況。挑出大小、形態(tài)、顏色、表面光澤度、透明度和質(zhì)地不同的菌落，用劃線平板法接種到新的牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上進行純化，并采用柯赫法則進行驗證，每天觀察接種海鮮菇菌包的發(fā)病情況至菌包外觀可見明顯病變時結(jié)束，并按照上述方法重新分離純化。

2) 革蘭氏染色和生理生化鑒定。先觀察平板上細(xì)菌菌落特征，再進行革蘭氏染色顯微鏡鏡檢，然后分別接種于休和利夫森二氏培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(含2%、5%和8% NaCl)測定葡萄糖氧化發(fā)酵作用，乙酰甲基甲醇試驗(V.P.試驗)及耐鹽性和需鹽性，并記錄結(jié)果[22]。

3) 16S rDNA分子鑒定。提取各細(xì)菌菌株的基因組DNA進行PCR擴增。PCR擴增所用引物為細(xì)菌通用引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA

G-3’和5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR擴增后產(chǎn)物委托華大基因進行純化和序列測定。測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行BLAST比較，得到一系列具有一定相似性的16S rDNA序列。下載GenBank數(shù)據(jù)庫中同源性較高的16S rDNA序列與該試驗所得細(xì)菌的16S rDNA序列對比，確定種屬，并利用MEGA 5.10的鄰近相鄰法計算菌株間的遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 抗菌藥劑的篩選 采用單因素試驗，每個藥劑處理濃度均分別為0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L。

1) 對污染細(xì)菌的抑制作用。用滅菌的直徑0.6 cm打孔器在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上均勻打3個孔，用移液槍吸取稀釋成不同濃度梯度的抑菌藥劑100 μL加到孔中，然后將各污染細(xì)菌菌液接種于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，涂抹均勻，37℃培養(yǎng)12 h后測量抑菌圈直徑大小并分析抗菌藥劑的作用效果及相關(guān)范圍。3次重復(fù)。

2) 對海鮮菇菌絲生長的抑制作用。在海鮮菇菌絲的PDA平板上，用打孔器取菌齡相同的菌塊(直徑0.6 cm)接種于抗菌藥劑PDA平板中央位置，25℃避光培養(yǎng)72 h后，采用十字劃線法測量菌絲生長速度。根據(jù)菌絲生長速度分析抗菌藥劑對海鮮菇菌絲生長的抑制作用。3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 污染細(xì)菌的分離鑒定

2.1.1 污染細(xì)菌的菌體形態(tài)特征和生理生化特性 從表1看出，試驗共分離純化得到6株污染細(xì)菌，分別標(biāo)記為XRA1、XRA2、XRA3、XRB1、XRC1和XRC2。其中，XRA1、XRA2、XRA3和XRB1革蘭氏染色為革蘭氏陽性細(xì)菌(G+)，XRC1和XRC2為革蘭氏陰性細(xì)菌(G-)；除XRC2菌體形狀為球狀外，其余菌體形態(tài)均為桿狀；菌落透明度低，為半透明至不透明；菌落形狀XRA1和XRA2為不規(guī)則形，其余為圓形且多凸起，顏色各異。從表2看出，將分離到的污染細(xì)菌菌株接到相應(yīng)的生理生化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48 h后，所有菌株均具有運動性，可發(fā)酵葡萄糖，但只有XRA3產(chǎn)氣；XRA1、XRA2、XRA3和XRC1在5% NaCl溶液中仍能正常生長，在8% NaCl溶液中6株菌株均不能正常生長。將分離純化的細(xì)菌回接到健康海鮮菇菌包，48 h后開始出現(xiàn)相同污染癥狀；再次對污染細(xì)菌進行分離純化培養(yǎng)，鑒定細(xì)菌為最初海鮮菇的污染菌，符合柯赫法則。

2.1.2 16S rDNA鑒定 6株污染細(xì)菌分別用細(xì)菌通用引物進行PCR擴增，結(jié)果均出現(xiàn)1條大小約1 500 bp較清晰的條帶(圖2)，與預(yù)期值相符，可用于后續(xù)測序工作。

表2 海鮮菇污染細(xì)菌的生理生化特性

注：“+”表示反應(yīng)為陽性；“-”表示反應(yīng)為陰性。

Note：“+”and “-”represent positive and negative reactions，respectively.

注：M，DL2000 Marker; 1～6，PCR擴增產(chǎn)物。

Note：M，DL2000 Marker; 1～6，PCR products.

圖2海鮮菇污染細(xì)菌16S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳

Fig.2 Electropherogram of PCR products of 16S rDNA ofH.marmoreuspathogenic bacteria

2.1.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 從圖3可見，XRA1與芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、XRA2與萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)、XRA3與微小桿菌屬(Exiguobacteriumsp.)、XRB1與嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、XRC1與粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、XRC2與糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)的同源相似性分別為98%、99%、98%、98%、98%和98%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性可以初步得出XRA1、XRA2、XRA3、XRB1、XRC1和XRC2分別屬于芽孢桿菌屬、萎縮芽孢桿菌、微小桿菌屬、嗜熱脂肪芽孢桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌和糞產(chǎn)堿菌。其中，XRA1和XRA3經(jīng)過比對目前只鑒定到屬。

圖3海鮮菇污染細(xì)菌菌株基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.3 Phylogenetic tree ofH.marmoreuspathogenic bacteria based on 16S rDNA sequence

2.2 海鮮菇污染細(xì)菌抗菌藥劑的篩選

2.2.1 抗菌藥劑對病原細(xì)菌的抑菌作用 從表3可見，5種抑菌劑對各病原細(xì)菌菌株的影響差異較大，其抑制作用均隨處理濃度增加而增強；其中，二氧化氯、二氯異氰尿酸鈉和新潔爾滅對污染細(xì)菌的抑制作用較強，在低濃度(50 mg/L)時對所有細(xì)菌的抑制作用均與對照差異顯著；克霉靈和多菌靈對污染細(xì)菌的抑制作用較弱，在低濃度(50 mg/L)時對大部分細(xì)菌的抑制作用與對照無顯著差異，高濃度(200 mg/L)時對部分細(xì)菌的抑制作用仍與對照無顯著差異。

2.2.2 抗菌藥劑對海鮮菇菌絲生長的抑制作用 從表3可見，5種抑菌劑對海鮮菇菌絲生長的抑制作用均隨處理濃度增加而增強；在低濃度(50 mg/L)時對海鮮菇菌絲生長的影響處理間及與對照間均無顯著差異。當(dāng)處理濃度>50 mg/L時，對海鮮菇菌絲生長的影響均與對照存在顯著差異。相同處理濃度二氧化氯、二氯異氰尿酸鈉和新潔爾滅的抑制作用均較克霉靈和多菌靈強。

綜上，海鮮菇工廠化生產(chǎn)中可以考慮使用較低濃度(50 mg/L)的二氧化氯、二氯異氰尿酸鈉和新潔爾滅抑制雜菌生長，為減少抗藥性的發(fā)生可選擇三者交替使用。

表3 抑菌劑對病原細(xì)菌及海鮮菇菌絲生長的抑制作用

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different letters in the same column indicate 5% significant level.

3 結(jié)論與討論

在海鮮菇工廠化生產(chǎn)的各個階段均會受到病原菌的侵染，其中培養(yǎng)料受污染影響最為嚴(yán)重。海鮮菇栽培中，病原菌可以通過空氣、滅菌不徹底的培養(yǎng)料、帶菌的操作環(huán)境引入。此外，菇蠅等害蟲可能攜帶有病菌，由此造成病害的侵染傳播。

研究首次針對海鮮菇工廠化生產(chǎn)中污染菌包的細(xì)菌進行調(diào)查分析，共分離得到污染細(xì)菌6株，通過形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定，確定其分別為芽孢桿菌屬、萎縮芽孢桿菌、微小桿菌屬、嗜熱脂肪芽孢桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌和糞產(chǎn)堿菌，其中，有2株細(xì)菌只鑒定到屬。污染細(xì)菌的種類多樣，也給海鮮菇生產(chǎn)中細(xì)菌病害的防治帶來一定的難度。

目前，在海鮮菇的實際生產(chǎn)中，除了盡量減少細(xì)菌污染的可能，抗菌藥劑的使用已成為防治食用菌雜菌污染的主要方法之一。研究結(jié)果表明，二氧化氯消毒液、二氯異氰尿酸鈉、40%克霉靈可濕性粉劑、新潔爾滅和50%多菌靈可濕性粉劑5種殺菌劑對上述幾種細(xì)菌生長均有抑制作用，但效果存在很大差異。低濃度(50 mg/L)的二氧化氯消毒液、二氯異氰尿酸鈉和新潔爾滅對各污染細(xì)菌均有較好的抑制作用，且對海鮮菇菌絲生長影響較小，在生產(chǎn)上可選擇三者交替使用，以降低菌株抗藥性的風(fēng)險。

試驗只對比分析5種抑菌藥劑對細(xì)菌和海鮮菇菌絲生長的抑制，對海鮮菇孢子萌發(fā)的抑制作用、不同細(xì)菌對海鮮菇致病性差異及治病機理等均未涉及，還有待進一步研究。另外，該試驗濃度是否適合生產(chǎn)中使用，對實際生產(chǎn)海鮮菇的產(chǎn)量、品質(zhì)是否有影響，是否有農(nóng)藥殘留超標(biāo)，以及實際應(yīng)用效果等尚待生產(chǎn)檢驗。