胡穎， 張晴， 葉蘭， 鄭濤

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 機能學(xué)實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 貴州 貴陽 550001)

子宮肌瘤又稱子宮平滑肌瘤，是女性生殖器中最常見的良性腫瘤，臨床常見的癥狀有子宮異常出血、壓迫癥狀、疼痛以及生育能力喪失等，嚴重威脅女性健康[1]。研究表明，子宮肌瘤的發(fā)生和發(fā)展與子宮平滑肌細胞的過度增殖關(guān)系密切[2]。本研究采用細胞生物學(xué)與中藥血清藥理學(xué)相結(jié)合的方法[3]，觀察婦科再造丸(FKW)含藥血清對體外原代培養(yǎng)的子宮肌瘤細胞增殖和凋亡的作用及對其人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)蛋白表達的影響，探討FKW抗子宮肌瘤的作用機理，為FKW臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本收集 標本取自2015年1月-2017年4月因子宮肌瘤而行子宮全切或肌瘤剔除術(shù)的絕經(jīng)前婦女，患者年齡35～50歲，術(shù)前3個月無類固醇激素使用史，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)診斷為子宮肌瘤。術(shù)中無菌條件下取子宮肌瘤組織1 cm3，置于3%雙抗(青霉素、鏈霉素)的PBS 10 mL中，密閉冰浴條件下盡快送入細胞培養(yǎng)室。

1.1.2實驗動物 清潔級3月齡Sprague-Dawley (SD)大鼠，雌性、體質(zhì)量(200±20) g、合格證號SCXK(黔)2012-0001，由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.3主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，胎牛血清(Hyclone)，DMSO(Sigma)，胰蛋白酶(Sigma)，MTT(Sigma)，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；兔抗人平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(Abcam)，PTEN抗體、PV6000免疫組化試劑盒及DAB(氨基聯(lián)苯胺)顯色試劑盒均購自北京中衫生物技術(shù)有限公司。酶標儀(BIO-RAD550型)，BDS200倒置生物學(xué)顯微鏡(重慶奧特光學(xué)有限責(zé)任公司)，流式細胞儀(Guava easyCyte)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，QL-901旋渦振蕩器(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)等。

1.1.4藥品 FKW(棕褐色丸劑)每10丸質(zhì)量2.6 g，貴陽德昌祥藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號20151021，試驗前用蒸餾水配制成高劑量112 g/L；中、低劑量組依次等比稀釋1倍，濃度分別為56 及28 g/L；桂枝茯苓膠囊(GuiZhi Fu Lin Jiao Nang,GZFLJN)，連云港康緣制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號150106，臨用前用蒸餾水配制成混懸液30 g/L。

1.2 方法

1.2.1FKW含藥血清的制備 取健康雌性SD大鼠60只，隨機分為無藥血清組，F(xiàn)KW低、中、高劑量組，GZFLJN組，每組12只。每只大鼠灌注：無藥血清組每次灌服生理鹽水10 mL/kg；FKW高、中、低劑量組每次灌服相應(yīng)藥液10 mL/kg，分別為成人等效劑量12.9倍、6.5倍及3.2倍；GZFLJN組每次灌服相應(yīng)藥液10 mL/kg，為成人等效劑量6.4倍。各組大鼠給藥2次/d，共3 d，第3天末次給藥1 h后經(jīng)股動脈取血，3 000 r/min離心20 min，分離血清，56 ℃恒溫30 min滅活補體，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2人子宮肌瘤細胞原代培養(yǎng)及鑒定[4]將肌瘤組織在無菌條件下用3%雙抗PBS液漂洗，在含DMEM培養(yǎng)液中剪碎為約1 mm3的組織塊，每塊間距2～3 mm擺放于培養(yǎng)瓶中，吸出培養(yǎng)液，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使瓶底朝上后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，4 h后將培養(yǎng)瓶翻正培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，約3～4周出現(xiàn)致密細胞層時取出組織塊，細胞生長融合達80%時，胰酶消化傳代。選擇生長良好、形態(tài)均一的第3～4代細胞用于后續(xù)實驗。傳代細胞均經(jīng)α-actin(α-平滑肌肌動蛋白)免疫細胞化學(xué)法鑒定證實。

1.2.3子宮肌瘤細胞增殖活力檢測 采用MTT比色分析法，將3～4代子宮肌瘤細胞消化成細胞懸液，調(diào)整濃度至6×109/L，每孔100 μL接種于96孔板(第一個孔留作空白)，于37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基后分別加入FKW低、中、高劑量組及GZFLJN組20%含藥血清處理細胞，以加入20%無藥血清組作為細胞對照，空白孔加入DMEM培養(yǎng)液作為空白對照，各設(shè)5個復(fù)孔，置正常條件下培養(yǎng)24、48及72 h，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，震蕩混勻15 min，酶標儀在490 nm處測定吸光度(OD)值。并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(1-用藥組OD值/細胞對照組OD值)×100%。

1.2.4子宮肌瘤細胞凋亡檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染色法流式細胞術(shù)，將第3～4次傳代培養(yǎng)的子宮肌瘤細胞接種于5個6 cm培養(yǎng)皿(>1×105/皿)，隨機分為細胞對照組、FKW低、中、高劑量組及GZFJN組，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，依實驗分組分別加入相應(yīng)的20%無藥血清及含藥血清培養(yǎng)液，根據(jù)MTT結(jié)果采用經(jīng)過各種藥物干預(yù)72 h的子宮肌瘤細胞，加入適量0.25%胰酶消化收集細胞，制備濃度為1×108/L的細胞懸液，取1 mL細胞懸液，離心后去上清液，Annexin V buffer液100 μL重懸，在細胞懸液中分別加入Annexin V-FITC 5 μL避光孵育20 min再加碘化丙啶(PI)染色液5 μL，室溫下避光孵育15 min，流式細胞儀檢測；實驗重復(fù)3次。

1.2.5PTEN表達 采用免疫細胞化學(xué)法，在6孔板中放上18 mm×20 mm的蓋玻片，肌瘤細胞以1×107/L密度接種，每孔100 μL，按1.2.4項下分組，每組設(shè)3個復(fù)孔。待細胞貼壁后，加入相應(yīng)的20%無藥血清及含藥血清培養(yǎng)液作用72 h，吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗3 min×2次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗5 min×3次，山羊血清封閉液孵育10 min，甩去多余液體，滴加一抗，4 ℃過夜，滴加二抗，二氨基聯(lián)苯氨顯色液(DAB)顯色，脫水，封片。結(jié)果判斷：DAB染色后陽性細胞細胞漿或細胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒，采用圖像分析軟件計算陽性細胞的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 人子宮肌瘤細胞原代培養(yǎng)及鑒定

培養(yǎng)第10天開始，組織塊邊緣有細胞游出，后隨時間延長逐漸分裂，最終融合成片。胞體細長，為不規(guī)則三角形或梭形，細胞生長呈放射狀或旋渦狀。α-actin單克隆抗體免疫細胞化學(xué)染色證實培養(yǎng)的子宮肌瘤細胞在傳代過程中始終保持平滑肌特性，肌瘤細胞純度高，陽性細胞數(shù)接近100%，可用于后續(xù)的實驗研究。

2.2 FKW含藥血清對子宮肌瘤細胞增殖的影響

結(jié)果顯示(見表1和圖1)，F(xiàn)KW含藥血清各劑量組干預(yù)24、48及72 h，各給藥組OD值均較細胞對照組明顯下降(P<0.05，或<0.01)，在同一時間點，隨著FKW濃度的增加，其增殖抑制作用逐漸增強，細胞增殖抑制率逐步升高(P<0.05，或<0.01)；同一藥液濃度下，各組作用72 h的抑制效應(yīng)較作用24、48 h顯著增強(P<0.05，或<0.01)，顯示呈劑量和時間依賴性。因此，在后續(xù)研究中選取72 h為研究的有效作用時間點。

圖1 藥物對子宮肌瘤細胞的抑制率Fig.1 Drug inhibition rate of uterine leiomyoma cells

表1 FKW含藥血清對子宮肌瘤細胞增殖的影響(n=5)Tab.1 Effects of FKW medicated serum on proliferation of human uterine leiomyoma cells

注：與細胞對照組比較,(1)P<0.05，(2)P<0.01；與FKW低劑量組比較,(3)P<0.01,(4)P<0.05；與FKW中劑量組比較,(5)P<0.05，(6)P<0.01；與24h處理組比較,(7)P<0.01,(8)P<0.05；與48h處理組比較,(9)P<0.05。

2.3 FKW含藥血清對子宮肌瘤細胞凋亡率的影響

流式細胞儀檢測顯示，細胞對照組未見明顯細胞凋亡，F(xiàn)KW含藥血清各劑量組細胞凋亡率均顯著高于細胞對照組(P<0.01)，且子宮肌瘤細胞凋亡率隨著濃度的增高逐步增高，呈遞增趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

注：(1)與細胞對照組比較, P<0.01；(2)與FKW低劑量組比較,P<0.01；(3)與FKW中劑量組比較， P<0.01。圖2 FKW對子宮肌瘤細胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of FKW medicated serum on apoptosis rate of uterine leiomyoma cells

2.4 FKW含藥血清對子宮肌瘤細胞PTEN表達的影響

免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，PTEN蛋白陽性染色定位于平滑肌細胞質(zhì)，呈棕黃色。FKW低、中、高劑量含藥血清分別作用于子宮肌瘤細胞72 h時，均顯著提高了PTEN蛋白的表達(P<0.01)，其中FKW高劑量組上調(diào)PTEN表達作用最為顯著，與FKW低、中劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2、圖3。

表2 FKW含藥血清對子宮肌瘤細胞PTEN表達的影響(光密度,Tab.2 Effect of FKW medicated serum on the expression of PTEN protein of uterine leiomyoma cells

注：(1)與細胞對照組比較,P<0.01；(2)與FKW低劑量組比較,P<0.01；(3)與FKW中劑量組比較，P<0.01。

圖3 各組子宮肌瘤細胞PTEN表達(免疫細胞化學(xué)染色，×100)Fig.3 Expression of PTEN protein detected by immunocytochemical staining

3 討論

中醫(yī)學(xué)認為子宮肌瘤屬“積聚”、 “癥瘕”等范疇，其病機以血瘀為主，瘀血是癥瘕形成的重要因素和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。FKW由當(dāng)歸、白芍、三七、丹參、益母草等42味中藥組成，丹參破血去瘀，行氣止痛；當(dāng)歸、三七補血、活血、止痛，白芍滋養(yǎng)陰血；全方合用能起消瘤散結(jié)、活血去瘀、理氣消滯、清熱解毒之功。FKW的臨床反饋提示其對子宮肌瘤有一定療效[5]，本課題組的前期研究亦表明，F(xiàn)KW對于雌、孕激素誘發(fā)的大鼠子宮平滑肌瘤樣增生有顯著的抑制作用[6]。

子宮肌瘤的發(fā)病機制復(fù)雜，與子宮平滑肌細胞過度增殖密切相關(guān)。本研究通過體外培養(yǎng)人子宮肌瘤細胞，建立子宮肌瘤細胞原代培養(yǎng)并傳代，且保持良好的細胞形態(tài)和生化特點。在培養(yǎng)的子宮肌瘤細胞中應(yīng)用FKW含藥血清后發(fā)現(xiàn)：FKW含藥血清以劑量-時間依賴性方式抑制子宮肌瘤細胞增殖，以FKW高劑量組作用72 h時抑制增殖作用最為顯著；FKW含藥血清干預(yù)72 h后，各給藥組細胞凋亡率顯著高于細胞對照組(P<0.01)，且隨藥物濃度增加呈遞增趨勢。上述研究表明FKW含藥血清可抑制子宮肌瘤細胞的增殖，促進子宮肌瘤細胞凋亡，加速細胞凋亡過程，進而控制肌瘤的生長。

PTEN是一種具有磷酸酶活性的抑癌基因[7]，其產(chǎn)物PTEN蛋白具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性，可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8-9]。磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidyrlinositol-3-kinase，PI3K)/Akt信號通路是由PI3K家族與其下游的直接靶蛋白絲/蘇氨酸蛋白激酶Akt或蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)組成，是重要的凋亡抑制通路，在調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化、存活和遷移等方面發(fā)揮作用[10]。PI3K/Akt信號通路的激活，可能通過調(diào)節(jié)其下游凋亡基因如bcl-2家族的活性、激活其下游分子Mtor、抑制糖原合成酶3的活性等機制而導(dǎo)致細胞存活及增殖，并保護細胞逃避凋亡[11-12]。PTEN的主要作用是對該通路產(chǎn)生負調(diào)控，實驗證實，PTEN主要是通過其脂質(zhì)磷酸酶活性作用于PI3K的下游靶分子三磷酸磷酯酰肌醇 (phosphatidylinosital triphosphate,PIP3)，從PIP3的3’去除磷酸將其轉(zhuǎn)變成二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositalbiphosphate,PIP2)，使Akt無法活化從而阻斷PI3K/Akt信號通路的抗凋亡作用[13]。多種腫瘤中都可檢測到PTEN的表達減少或缺失。有學(xué)者通過免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)PTEN在正常子宮肌層中高表達，在子宮肌瘤組織中表達強度顯著降低[14]，故認為PTEN在正常子宮肌層中通過阻斷PI3K/Akt通路促進細胞正常凋亡，抑制細胞增殖；而在子宮肌瘤組織中由于表達降低而失去了對此通路的抑制，無法發(fā)揮其對細胞生長增殖的負性調(diào)節(jié)作用，因此促進了子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，與細胞對照組比較，F(xiàn)KW含藥血清各劑量組均能不同程度提高子宮肌瘤細胞PTEN表達(P<0.01)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)FKW含藥血清抑制增殖和促進凋亡的作用可能是通過上調(diào)PTEN的表達，進而抑制PI3K/Akt信號通路的過度活化而實現(xiàn)的，其具體的作用機制需進一步深入研究。