陳世裕，喻超，潘耀振，陳玲，李琳，楊哲豪，呂彥霖，鄧路，孫誠誼**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 肝膽胰脾重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；4.貴州省肝膽胰脾疾病研究所，貴州 貴陽 550004)

胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是全球癌癥相關(guān)死亡率最高的第四大疾病[1-2]，盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)取得了顯著的進(jìn)步，但PC病人的生存率仍然較低，5年總生存率僅為7%，平均生存時(shí)間<9個(gè)月[2-4]。早期診斷PC、采取恰當(dāng)?shù)氖中g(shù)方式和化療，是治療PC的有效方法[5-6]；但由于PC早期缺乏明確診斷的分子標(biāo)志物，因此大部分PC患者在明確診斷時(shí)已經(jīng)失去了手術(shù)切除機(jī)會(huì)，治療預(yù)后不良。因此，研究PC細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移的分子機(jī)制，對治療PC及改善其預(yù)后具有重要的意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì)的 RNA，主要參與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白功能等生物過程[7-8]。研究表明，LncRNA 能通過表觀遺傳修飾、RNA 降解及翻譯后修飾等方式激活促癌基因或沉默抑癌基因，參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等過程[9-11]。整合素蛋白家族 (integrin family,ITG) 是廣泛分布于細(xì)胞表面的四類細(xì)胞黏附分子之一，是由α及β兩個(gè)亞基組成的異源二聚體跨膜蛋白整合素家族，可以改變腫瘤的增殖、侵襲及遷移等多種生物學(xué)功能[12-14]；整合素 β2 (ITGβ2)主要在各種白細(xì)胞的表面表達(dá)，并能夠和腫瘤細(xì)胞表面的黏附分子結(jié)合，從而賦予腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力[15-17]。LncRNA ITGβ2-AS1起源于ITGβ2啟動(dòng)子，LncRNA ITGβ2-AS1通過上調(diào)ITGβ2的表達(dá)從而促進(jìn)乳腺癌的侵襲和遷移[18]。但是，LncRNA ITGβ2-AS1是否參與PC的發(fā)生及發(fā)展尚待進(jìn)一步研究，本項(xiàng)研究主要從增殖、侵襲及遷移等方面研究LncRNA ITGβ2-AS1在PC中所起到的作用和分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株為中山大學(xué)腫瘤防治中心惠贈(zèng)，胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(TRYPSIN)、DMEM及RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國gibco公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自Beyotime公司，Transwell侵襲小室購自美國Corning公司，Matrigel購自美國BD公司，RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，ITGβ2-AS1-sh購自RIBOBIO公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix ExTaq試劑盒均購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 利用cBioPortal網(wǎng)站在線分析癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫分析179例PC癌組織及171例癌旁組織ITGβ2-AS1的表達(dá)情況。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株HPDE和人PC細(xì)胞株AsPC-1、CFPAC-1、PANC-1、MIA PaCa-2、Capan-2、BxPC-3、Hs766T及SW1990分別使用含10%FBS的DMEM及RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、含5% CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。

1.2.3ITGβ2-AS1 mRNA表達(dá) 選擇處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞株，提取其總RNA，分別測量A260/A280時(shí)的吸光度，選取吸光度值在1.8～2.0的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明，分別將樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再選擇GAPDH作為內(nèi)參，使用SYBR Premix ExTaq試劑盒進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.4細(xì)胞增殖 根據(jù)mRNA表達(dá)的結(jié)果，選取表達(dá)升高倍數(shù)最大的PANC-1細(xì)胞作為細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株，利用慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，構(gòu)建ITGβ2-AS1干擾陰性對照組(Negative Control組)及ITGβ2-AS1干擾組(ITGβ2-AS1-sh組)。分別取對數(shù)生長期的兩組細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，按照3×103/孔的數(shù)量接種于96孔板中，設(shè)6、24、48及72 h時(shí)間點(diǎn)，在每個(gè)對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)再分別設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔均加入CCK-8試劑10 μL，于避光條件下置37 ℃恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h后取出，輕微震蕩搖勻后，置酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定OD值。

1.2.5平板克隆實(shí)驗(yàn) 分別取1.2.4項(xiàng)下對數(shù)生長期的兩組細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，于6孔板中種植1×103個(gè)細(xì)胞，置37 ℃恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d后，用4%多聚甲醛固定20～30 min、0.25%結(jié)晶紫染液染色20～30 min，于流水中沖洗數(shù)遍后置烘箱中烘干，拍照記錄。

1.2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 分別取1.2.4項(xiàng)下對數(shù)生長期的兩組細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，于6孔板中種植5×105個(gè)細(xì)胞，待其均勻鋪開成單層并長至90%時(shí)，用200 μL槍頭置各孔上方的直尺垂直均勻下劃，用PBS清洗干凈后、加入不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，分別于0及48 h置顯微鏡下拍照記錄。

1.2.7細(xì)胞侵襲及遷移實(shí)驗(yàn) 分別取1.2.4項(xiàng)下處于對數(shù)生長期的兩組細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h后消化并計(jì)數(shù)，在上室種植含2×105個(gè)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基細(xì)胞重懸液200 μL(種植前上室將Matrigel與無血清培養(yǎng)基按照1 ∶8的比例鋪上稀釋過的 Matrigel 60 μL)，下室加入700 μL完全培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～30 h后取出，用4%多聚甲醛固定20～30 min、0.25%結(jié)晶紫染液染色20～30 min，用棉簽清洗上室、烘箱烘干，置顯微鏡下拍照記錄(遷移實(shí)驗(yàn)不加Matrigel，其余步驟同上)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ITGβ2-AS1表達(dá)

分析TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果如圖1A所示，ITGβ2-AS1在PC組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)；如圖1B的qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，ITGβ2-AS1在8株人PC細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE，其中在PANC-1細(xì)胞株中表達(dá)升高的倍數(shù)最大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

(1)與癌旁組織比較，P<0.05；(2)與HPDE細(xì)胞比較，P<0.05。圖1 ITGβ2-AS1在PC組織及細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of ITGβ2-AS1 in pancreatic cancer tissues and cells

2.2 ITGβ2-AS1對PC細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)48 、72 h時(shí)，ITGβ2-AS1-sh組與Negative Control組比較，450 nm波長處的OD值顯著下降(見圖2A)；平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Negative Control組中細(xì)胞集落形成數(shù)量為(308.3±12.7)個(gè)，ITGβ2-AS1-sh組為(165±9.4)個(gè)(見圖2B)；結(jié)果顯示干擾ITGβ2-AS1后，PC細(xì)胞的增殖能力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 ITGβ2-AS1對PC細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同時(shí)間點(diǎn)，ITGβ2-AS1-sh組與Negative Control組比較，PC細(xì)胞的遷移距離變短(見圖3A)；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Negative Control組中PC細(xì)胞的數(shù)目為遷移(627±15)個(gè)、侵襲(428±32)個(gè)，ITGβ2-AS1-sh組為遷移(312±26)個(gè)、侵襲(239±21)個(gè)(見圖3B)；結(jié)果顯示，干擾ITGβ2-AS1后，PC細(xì)胞的遷移及侵襲能力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：(1)與ITGβ2-AS1-sh組比較，P<0.05。圖2 ITGβ2-AS1對PC細(xì)胞增殖能力的影響Fig.2 Effect of ITGβ2-AS1 on proliferation of pancreatic cancer cells

注：(1)與ITGβ2-AS1組比較，P<0.05。圖3 ITGβ2-AS1對PC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.3 Effect of ITGβ2-AS1 on migration and invasion of pancreatic cancer cells

2.4 ITGβ2-AS1對PC細(xì)胞ITGβ2表達(dá)水平的影響

ITGβ2-AS1與ITGβ2的相關(guān)性回歸分析結(jié)果顯示，ITGβ2-AS1與ITGβ2的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05，r=0.41)。qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾ITGβ2-AS1后，ITGβ2在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均顯著下降，提示ITGβ2-AS1與ITGβ2存在共表達(dá)關(guān)系，干擾ITGβ2-AS1后ITGβ2的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：(1)與Negative Control組比較，P<0.05。圖4 ITGβ2-AS1對PC細(xì)胞ITGβ2表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of ITGβ2-AS1 on the expression of ITGβ2 in pancreatic cancer cells

3 討論

目前，越來越多的研究表明LncRNA在包括PC在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[19-22]。已有研究報(bào)道LncRNA ITGβ2-AS1在乳腺癌組織中的表達(dá)與癌旁組織相比明顯上調(diào)，預(yù)示著臨床上的不良預(yù)后[18]。腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移等惡性生物學(xué)行為特性是罹患腫瘤的病人治療困難以及預(yù)后不良的最主要原因。因此，本課題組圍繞LncRNA ITGβ2-AS1在PC的病理生理過程中的作用展開研究。TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，ITGβ2-AS1在PC組織中的表達(dá)與癌旁組織相比明顯上升。本研究進(jìn)一步通過qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ITGβ2-AS1在人PC細(xì)胞中的表達(dá)與人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞相比顯著上調(diào)。因此，本研究推測ITGβ2-AS1可能與PC的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。

有研究報(bào)道，ITGβ2-AS1可以通過上調(diào)EMT相關(guān)蛋白ITGβ2的表達(dá)從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[18]。因此，本研究推測可以通過干擾ITGβ2-AS1從而抑制PC細(xì)胞的侵襲及遷移。本研究進(jìn)一步通過一系列相關(guān)的細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)深入研究，CCK-8、平板克隆、細(xì)胞劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，干擾ITGβ2-AS1后，PC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力顯著下降。qPCR及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，干擾ITGβ2-AS1后ITGβ2的表達(dá)下降。推測ITGβ2-AS1可能具有調(diào)控PC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用。

綜上所述，本項(xiàng)研究在體外初步驗(yàn)證了在干擾LncRNA ITGβ2-AS1后，PC細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力受到抑制，有望為尋求治療PC的新型分子靶點(diǎn)提供思路。然而，其具體的作用途徑及分子生物學(xué)機(jī)制尚未明確，還需要進(jìn)一步的探索及研究予以闡明。