胡榮光，趙彥宏，張瑞萍，張安民*，錢帥偉

（1.山西財經(jīng)大學 體育學院，山西 太原030006；2.魯東大學 農(nóng)學院，山東 煙臺264025；3.煙臺大學 體育學院，山東 煙臺264005）

間歇訓練特別是高強度間歇運動對人體肌肉、心臟等器官都形成較大刺激，可顯著增強心臟泵血功能、引起心臟生理性肥大（Ito et al.,2016），但同時又有引起心肌缺血、心肌纖維化等病理過程的潛在風險（饒志堅 等,2016；王林佳 等,2016）。隨著表觀遺傳學的不斷發(fā)展，有研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）可通過調控其靶基因表達而參與調節(jié)心肌細胞的增殖、分化、凋亡等生理過程（錢帥偉 等,2014）。因此，可從間歇訓練誘導miRNA及其靶基因表達變化的視角，研究間歇訓練導致心臟重塑的可能調控通路。

miRNA 是一類廣泛存在于動植物體內的小分子非編碼RNA，長度約為18～25 個核苷酸，主要通過轉錄后水平的負性調控，實現(xiàn)對基因表達的調節(jié)作用（賈明學 等,2013）。已有研究表明，不同運動方式、強度和時間可引起心臟miRNA 的應答，影響基因表達和蛋白質的翻譯，進而影響心臟功能，目前已證實有miR-1、miR-21、miR-24、miR-29、miR-133、miR-155、miR-146a、miR-208、miR-350、miR-30c 等參與運動心臟的重塑過程（饒志堅 等,2017a,2017b；王世強 等,2017；翟帥 等,2014；張振輝 等,2012；趙永才,2012），但以往研究結果傾向于對心臟功能的“良性”影響，而對“風險”miRNA 的客觀研究和闡釋不足。心臟功能的維持是眾多呈現(xiàn)空間特異性與高度時效性表達的基因共同參與的結果，不同功能的基因共同組成一個復雜的調控網(wǎng)絡，其中必然有許多能夠響應間歇訓練的miRNA參與對這些基因的調控。那么，除了目前發(fā)現(xiàn)的幾種miRNA，心臟還有哪些能夠響應間歇訓練的運動刺激？參與調控的特異性miRNA 及其靶基因分別有什么作用？這些miRNA 調控其靶基因的機制為何？隨著運動分子生物學的深入研究，這些問題將是今后研究的焦點問題。本研究旨在鑒定大鼠心臟中響應高強度間歇運動而差異表達的miRNA，并根據(jù)miRNA 與其靶基因的表達譜，解釋大鼠心臟響應高強度間歇運動的基因表達調控通路。

1 材料與方法

1.1 研究對象與分組

選取健康雄性Wistar 大鼠20 只，隨機分為2 組，對照（control check，CK）組10 只，高強度間歇游泳訓練（high- intensity intermittent swimming training，HIST）組10 只。室溫20℃～25℃，濕度45%～60%，光照時間14 h/天。動物經(jīng)3 天時間適應環(huán)境后開始建模訓練。

1.2 訓練模型建立

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，有訓練大鼠對一次高強度間歇運動的應激反應程度雖不如安靜大鼠表現(xiàn)強烈，但同樣能夠反映一次HIST 的應激生理反應，且實驗結果的一致性明顯好于安靜大鼠，數(shù)據(jù)離散程度更低，可靠性更高，因此，本研究選擇有訓練大鼠作為實驗對象（張瑞萍 等,2011）。

根據(jù)Mcardle（1967）、Voltarelli（2002）的理論，參考徐玉林（1999）、嚴翊（2006）的研究方法，建立大鼠HIST 模型（張瑞萍 等,2011）。游泳條件：塑鋼玻璃游泳池，長×寬×高為150×60×70 cm；泳池內水深為大鼠身體長度的2 倍，約60 cm；水溫33℃～36℃。適應性游泳3 天，每天1 次，每次持續(xù)時間依次為第1 天15 min、第2天20 min、第3 天30 min，剔除不擅游泳者。隨后開始正式間歇負重游泳訓練，每周連續(xù)訓練6 天，第7 天休息，共訓練6 周。運動強度為尾部負重體重的5%，游泳持續(xù)6 min，休息4 min，每天連續(xù)進行10 輪；游泳期間觀察記錄大鼠的運動能力及活動狀態(tài)，當大鼠浮在水面不運動時用木棒驅趕使其維持運動，當大鼠下沉水下無能力浮上時立刻托起減少負重至3%；訓練結束后吹干毛發(fā)，放回鼠籠。

為判斷模型是否建立成功，在第1 周第1 天訓練前、第 1 天每 1 輪次后分別測量大鼠血乳酸（德國 EKF Lactate-Scout 血乳酸儀），依次標記為安靜值、變化值1、變化值2、……、變化值10。CK 組不做任何運動，常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動。

1.3 動物取材

第6 周第6 天HIST 組、CK 組均進行間歇負重游泳訓練，結束后即刻進行動物取材。兩組大鼠立即同時注射麻醉，并斷頸處死，解剖出心臟左心室肌，立即放入液氮中冷凍。最后保存于-80℃冰箱中備用。

1.4 miRNA 分離與文庫構建

在液氮中將每只大鼠左心室肌樣品研磨成粉末，并用TRIzol 試劑（Invitrogen 公司）提取總RNA，將各RNA 樣品按組等量混合成2 個RNA 樣品池：HIST 組RNA 樣品池與CK 組RNA 樣品池。通過15%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳從各RNA 樣品池中分別分離純化出16～30 nt 的小RNA（sRNA）。然后用T4 RNA 連接酶在每個小RNA 的5'段和3'端加上接頭，用SuperScript Ⅱ反轉錄酶（Invitrogen 公司）將其合成為cDNA，再經(jīng)過RT-PCR 擴增獲得雙鏈cDNA。經(jīng)10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、回收及純化后的cDNA 用于構建sRNA 測序文庫。采用NEB Next Ultra small RNA Sample Library Prep Kit for Illumina 試劑盒構建sRNA 測序文庫。最后由北京百邁客生物公司在Illumina HiSeq2500 測序儀上進行高通量測序分析。

1.5 高通量測序數(shù)據(jù)的預處理

在高通量測序原始數(shù)據(jù)的基礎上，對其進行如下過濾處理：1）將低質量序列去掉；2）去除包含未知堿基的reads；3）去除沒有3'接頭序列的reads；4）剪切掉3'接頭序列；5）去除短于18 nt 或長于30 nt 的序列。經(jīng)過濾處理后，獲得長度為18～30 nt 的高質量的clean reads。然后，再通過對Rfam 和GenBank 數(shù)據(jù)庫進行相似性搜索，過濾掉可能是mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、srpRNA 和scRNA 等的序列。

1.6 已知miRNA 的鑒定

運用BLAST 程序，將過濾后剩余的sRNA 序列與miRBase 數(shù)據(jù)庫搜索比對，凡是能與數(shù)據(jù)庫中已儲存動物物種的已知miRNA 匹配的sRNA 序列，就可以將其看作是一個已知miRNA。

1.7 預測新的候選miRNA

運用Soap 程序將剩余未注釋的sRNA 序列與大鼠基因組序列進行比對，挑選出能與大鼠基因組序列完美匹配的sRNA 序列。然后，利用miRNA 預測軟件MIREAP 從中預測出新的候選miRNA（novel miRNA）。

1.8 miRNA 差異表達分析

基于sRNA 高通量測序數(shù)據(jù)，計算出每個miRNA 的表達量。首先將兩組大鼠各自miRNA 的表達量進行標準化處理，然后對這兩組間的miRNA 進行差異表達分析。使用|log2（FC）|≥1 且錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）≤0.01 作為差異表達的篩選標準（Jiang et al.,2018），其中，以差異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）表示兩組間表達量的比值，即HIST 組表達量與CK 組表達量之間的比值。若log2（FC）≥1，則表示miRNA表達上調；若log2（FC）≤-1，則表示miRNA 表達下調。

1.9 miRNA 靶基因預測及功能富集分析

針對差異表達miRNA，運用miRNA 靶基因預測軟件miRanda、RNAhybrid 和TargetScan 從NCBI 數(shù)據(jù)庫中大鼠基因對應的cDNA 序列中預測出miRNA 對應的靶基因。這里使用大鼠基因對應的cDNA 序列來自：（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/gene/DATA/GENE_INFO/Mammalia/Rattus_norvegicus.gen e_info）。然后，對miRNA 靶基因進行功能注釋，對其進行GO 與KEGG 分析，進而預測出miRNA 可能的調控功能。

2 結果與分析

2.1 建模情況

第1 周第1 天測得血乳酸安靜值（6.79±1.41 mmol/L），血乳酸變化值隨輪次增加逐漸遞增且變化值均大于安靜值，根據(jù)Voltarelli（2002）的理論，符合高強度間歇游泳運動的模型標準，模型建立成功。訓練期間第1 周出現(xiàn)第8～10 輪次訓練時部分大鼠不能堅持的情況（累計13 鼠·輪次），作減重至3%處理后完成訓練，之后訓練過程中所有大鼠均能堅持做完負重5%體重的間歇訓練，建模達到預期效果。

2.2 miRNA 高通測序數(shù)據(jù)預處理與分析

經(jīng)高通量測序，CK 組大鼠獲得15 499 132 條測序原始數(shù)據(jù)（raw reads），HIST 組獲得15 803 934 條raw reads。經(jīng)過濾處理后，各自分別得到13 864 049（CK 組）和14 460 159（HIST 組）條過濾后得到的Reads 數(shù)據(jù)（clean reads）（表1）。其中，CK 組有8 901 163（64.2%）條reads 被定位（mapped）到大鼠基因組上，HIST 組有8 904 502（61.58%）條reads 被定位到大鼠基因組上。

表1 sRNA 高通測序數(shù)據(jù)的概括統(tǒng)計Table 1 Summary Statistics of Small RNA Deep Sequencing

對過濾處理后的clean reads 進行長度分布分析，發(fā)現(xiàn)90%以上reads 長度集中在20～24 nt 之間，其中長度為22 nt 的read 最多，約占到了總clean reads 的一半（圖1）。由此可見，測序得到的sRNA 序列的長度分布趨勢與動物中成熟miRNA 的長度分布是一致的。

圖1 不同長度的cleans reads 分布圖Figure 1.The Distribution of Cleans Reads with Different Length

圖2 兩組大鼠組間共有及特有sRNA 的種類、數(shù)量韋恩圖Figure 2.Wayne Diagram of Common and Specific Reads of Uniq_sRNA and Total_sRNA between Groups

兩組大鼠中共有和特有的sRNA 種類（uniq_sRNA）和數(shù)量（total_sRNA）（圖2）。兩組共有的uniq_sRNA 是15.48%，共有的total_sRNA 是97.02%，這說明，二者共有的sRNA 表達量很高。

在clean reads（sRNA）中，通過數(shù)據(jù)庫搜索比對，去除非miRNA 的序列（如mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，srpRNA，scRNA，repeat-associated elements 等）后，CK 組與HIST 組分別得到了13 135 777 條和13 429 514條未被注釋的序列（表2）。

表2 兩組大鼠文庫中各種sRNA 的分布Table 2 Classification/Annotation of Small RNAs in Two Groups' Libraries

2.3 大鼠心臟已知miRNA 識別與新miRNA 預測

所有樣品共鑒定出868 個miRNA，其中，已知miRNA 531 個，新預測miRNA337 個（表3）。

2.3.1 已知miRNA 的識別

通過比對miRBase 數(shù)據(jù)，兩組大鼠共找出531 個已知miRNA，CK 組找到495 個已知miRNA，HIST 組找到498個已知miRNA。其中，兩組共有的已知miRNA 有462個，CK 組特有的為33 個，HIST 組特有的為36 個。兩組中表達最多的10 個已知miRNA 信息如表4所示。

表3 兩組大鼠miRNA 概括統(tǒng)計Table 3 Summary Statistics of miRNAs in Two Groups' Libraries/n

表4 兩組大鼠表達最多的已知miRNATable 4 The Most Abundant Known miRNAs Obtained from Two Groups' Libraries

2.3.2 新miRNA 預測

采用miRNA 預測軟件MIREAP，兩組共預測出337 個新的miRNA，CK 組預測出288 個新miRNA，HIST 組預測出288 個新miRNA。其中，兩組共有的新miRNA 有239個，CK 組特有的為49 個，HIST 組特有的為49 個。新miRNA 的首位堿基偏向于U，長度分布在18～25 nt，其中以22 nt 為主，這些特征均與目前大鼠中已知序列特征相符。根據(jù)目前miRNA 的命名規(guī)則并參考不同物種的習慣命名法，本研究對新預測的miRNA 進行了命名，分別被命名為rno-miR-n001 到rno-miR-n337。兩組中表達最多的10個新miRNA 信息如表5所示。

2.4 miRNA 差異表達分析

通過差異表達分析發(fā)現(xiàn)，HIST 組與CK 組大鼠之間大多數(shù)miRNA 的表達無顯著差異，但也發(fā)現(xiàn)32 個miRNA 存在顯著的差異表達（圖3、表6）。與CK 組大鼠相比，HIST 組顯著上調表達的miRNA 共22 個，顯著下調表達的miRNA 共10 個。這證實了高強度間歇游泳運動能誘導大鼠心肌中miRNA 發(fā)生顯著的差異表達。其中，rno-miRn106 只在CK 組中表達，而在HIST 組中沒有檢測到其表達。有7 個miRNA 的表達FC 達到了4 倍以上（|log2（FC）|≥2），分別是miR-212-3p、miR-132-5p、rnomiR-n150、miR-212-5p、rno-miR-n117、miR-122-5p、rno-miR-n106。由此可見，高強度間歇游泳運動確實能夠誘導心臟中miRNA 的差異表達。

2.5 差異表達miRNA 靶基因預測及其功能分析

2.5.1 靶基因預測

在所有32 個響應高強度間歇運動的差異表達miRNA中，有25 個miRNA 共預測出1 197 個靶基因，平均每個miRNA 有47.88 個靶基因；其他的7 個差異表達miRNA 未能預測到對應的靶基因。除miR-124-3p、miR-200a-5p 僅預測到1 個靶基因外，其余miRNA 均能同時預測到多個靶基因，且存在不同miRNA 靶向同一編碼基因的情況，例如，miR-503-3p 和miR-6315 都能調控Tet3，miR-132-5p和miR-503-3p 都能調控Pyroxd2。由此可見，差異表達miRNA 可能參與了眾多基因的表達調控。

2.5.2 靶基因功能注釋

通過對miRNA 靶基因進行功能注釋，發(fā)現(xiàn)靶基因及其編碼蛋白參與心臟多種生理功能的調控。這些靶基因包括涉及心肌細胞增殖、分化（如Tenm4、Rxrb、Rbp4、Prickle1、Foxs1），心肌凋亡（如Ltk），心肌發(fā)育和形態(tài)發(fā)生（如Epo、Foxs1、Actl10、Epor、Gja1、Srf、Camk2a），心肌收縮（如Srf、Camk2a），心肌肥厚調節(jié)（如Akap13），心臟傳導（如Gja1），轉錄調控（如Rxrb、Rbp4、Prickle1、Epo、Foxs1、Srf）（表7）。

為了進一步分析差異表達miRNA 靶基因功能，本研究對這些靶基因進行了GO 分析與KEGG 分析。組間差異表達miRNA 靶基因GO 注釋結果表明，差異表達的miRNA所對應的靶基因主要涉及的生物學過程包括細胞的生長、代謝、應激、調節(jié)、免疫、細胞生理等、細胞組分包括細胞膜、細胞器和細胞外基質等；生物分子功能包括催化活性、轉運活性、酶調節(jié)活性及結合活性等（圖4）。

組間差異表達miRNA 靶基因的KEGG 注釋結果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)其參與腎素-血管緊張素系統(tǒng)、MAPK 通路、Hippo 通路、PI3K-Akt 信號通路、PPAR 信號通路、AMPK信號通路、胰島素信號傳導通路、p53 信號通路、病毒性心肌炎炎癥通路、cGMP-PKG 信號通路、mRNA 監(jiān)控通路等多條信號轉導通路。

KEGG 通路的富集分析結果如圖6所示，研究發(fā)現(xiàn)，這些靶基因在病毒性心肌炎炎癥通路、cGMP-PKG 通路的富集水平明顯高于其他通路，這說明，參與病毒性心肌炎炎癥通路與cGMP-PKG 通路的靶基因最多。

圖4 靶基因GO 注釋圖Figure 4.GO Annotation of Target Genes

圖5 靶基因KEGG 分類圖Figure 5.KEGG Classification Diagram of Target Genes

圖6 靶基因KEGG 通路富集散點圖Figure 6.KEGG Enrichment Scatter Plot of Target Genes

3 討論

間歇訓練法起源于20世紀初，并由德國生理學家Hans Reindell 和教練員Woldemar Gerschler 于20世紀40年代正式提出，因其具有顯著增強心泵功能的作用，長期廣泛應用于運動訓練領域（鄧樹勛,1990；黎涌明,2015；劉瑞東 等,2017）。關于間歇訓練增強心泵功能的機制研究，國內外學者主要集中于抑制心肌凋亡、促進心肌代謝、增強心肌肌原纖維收縮等方面，研究方法主要有心功能評定、代謝組學、蛋白質檢測及其基因表達分析等（董蕾,2012；李麗 等,2017；田振軍 等,2015）。miRNA 是一種可以調控基因表達的小分子非編碼核糖核酸，從心肌miRNA 的視角探究間歇訓練對心臟基因表達的影響，具有重要的研究價值。

3.1 高強度間歇運動誘導心臟miRNA 產(chǎn)生的不同調控趨向

3.1.1 上調表達的心肌miRNA

本研究根據(jù)miRNA 整體表達情況以及兩組間的變化特征，對差異表達miRNA 進行后續(xù)分析。在篩選出的22 個上調表達miRNA 中，多數(shù)已有相關研究報道，如韓志華（2014）發(fā)現(xiàn)，miR-27a 通過SMAD-Akt-mTOR 通路誘導缺血心肌自噬，抑制細胞凋亡，減輕心肌細胞損傷，保護細胞功能。Eskildsen 等（2015）發(fā)現(xiàn)，心臟肥大、心力衰竭會促使miR-132、miR-212 上調，miR-132 在房顫的發(fā)生中也出現(xiàn)上調的趨勢（Qiao et al.,2017）。Wang 等（2016）發(fā)現(xiàn)，miR-134-5p 在急性心力衰竭早期顯著增加。張在保（2013）發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病大鼠心肌梗死后缺血區(qū)miR-503 表達上調。Díaz 等（2017）發(fā)現(xiàn)，miR-125a-3p 在心肌缺血細胞中表達上調。有些篩出的miRNA 雖無相關報道證實其在心肌細胞中的調控作用，但在循環(huán)血液miRNA 的研究中發(fā)現(xiàn)了它們對心臟功能的作用，如Kinno 等（2014）發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-411、miR-409 在房顫的發(fā)生中表達上調；Harling 等（2017）發(fā)現(xiàn)在術后房顫患者血清中miR-483-5p 過度表達。這些研究印證了本研究的預測結果，也提示了這些差異表達miRNA 在響應間歇運動中的作用，既有可能使心臟發(fā)生缺血心肌自噬的保護機制，也存在心力衰竭、心肌缺血、心律失常（如房顫）等可能的變化過程。

3.1.2 下調表達的心肌miRNA

與CK 組大鼠相比，有10 個miRNA 在HIST 組表現(xiàn)出下調趨勢，其中的多數(shù)miRNA 也已有相關研究報道，如Xu 等（2016）發(fā)現(xiàn)，miR-429 下調可引起Notch1 表達增加，進而達到保護心肌細胞免于缺氧誘導的細胞凋亡；Soci 等（2016）發(fā)現(xiàn)高強度游泳運動可使miR-208b 下調，誘導心肌生理性肥大。Liu 等（2016）、Dias 等（2016）發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死引起的心力衰竭大鼠心臟中，miR-122-5p表達上調，提示miR-122-5p 有促心肌細胞凋亡的作用。Li等（2016）發(fā)現(xiàn)，miR-182 可通過Akt-mTOR-p70S6K 通路，抑制 Bcat2 表達，誘導心肌病理性肥大的發(fā)生；Cakmak 等（2015）發(fā)現(xiàn)，充血性心力衰竭與miR-182 的上調表達有關；Wang 等（2018）發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠出現(xiàn)心臟舒張功能下降、心肌纖維化、自發(fā)性高血壓等表現(xiàn)，這可能與miR-182、miR-208b-3p 的上調有關系。劉長召等（2017）發(fā)現(xiàn)，miR-200b-3p 可能通過調控FSTL1 的表達而參與心肌細胞的炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡等過程，誘導心肌梗死的出現(xiàn)。Yvan 等（2017）發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miR-124-3p 的上調與心臟驟停的發(fā)生有關。前人的研究提示，這些miRNA 響應高強度間歇運動而出現(xiàn)的下調表達對于抑制心肌凋亡、抑制心力衰竭、抑制心肌纖維化、誘導心肌生理性肥大、維持心臟正常功能具有重要意義，在HIST 導致的心臟重塑中起到“良性”作用。

而其他下調表達的miRNA 被驗證具有相反的作用，如Yao 等（2017）發(fā)現(xiàn)，miR-183-5p 上調表達可阻斷內質網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡和心力衰竭；Yang 等（2018）發(fā)現(xiàn)，miR-200a-5p 可通過靶向RNF11 阻斷心肌細胞凋亡；Fang等（2015）發(fā)現(xiàn)，肥厚型心肌病患者（HCM）的彌漫性心肌纖維化的發(fā)生伴隨循環(huán)miR-96-5p 的下調表達。上述研究提示，這些miRNA 在HIST 組心肌中的下調表達增加了心肌凋亡、心肌纖維化、心力衰竭的可能性，在HIST 導致的心臟重塑中起著“風險”作用。

綜上，這些下調表達的miRNAs 也在心臟響應間歇運動中發(fā)揮不同的作用，既有誘導心肌生理性肥大、抑制心肌凋亡、保護心肌細胞的作用，又有誘發(fā)心力衰竭、心肌纖維化和心肌凋亡的風險。

根據(jù)上調、下調miRNA 及其前人研究證據(jù)，可以推測在高強度間歇運動導致心臟重塑的過程中，miRNA 對基因表達的調控可表現(xiàn)出多向性，既可能向心臟生理性肥大、保護心肌等良性方向發(fā)展，也可能演變?yōu)樾牧λソ?、心肌缺血、心肌纖維化、心肌凋亡、心律失常等惡性的病理過程（表8），而不同miRNA 的表達會影響其向不同的方向發(fā)展，心肌重塑的最終發(fā)展方向，受多種miRNA 共同作用的影響。這種眾多miRNA 共同調控基因表達的機制，有待于進一步研究。而miR-6315、miR-6324、miR-664-2-5p、miR-191a-3p 等是否與運動心臟重塑或病理性心臟重塑有關尚未見報道，后續(xù)可進一步進行這部分研究。

3.2 miRNA 通過對靶基因調控實現(xiàn)對心臟生理活動的影響

miRNA 通過調控靶基因發(fā)揮作用，因此，本研究對差異表達的miRNA 進行了靶基因注釋，并與以前報道的參與運動響應的基因進行比較，發(fā)現(xiàn)，間歇游泳運動響應的miRNA 可通過調控不同的靶基因介入心肌細胞多種生理生化過程，包括涉及心肌細胞增殖與分化、心肌收縮、心肌發(fā)育與形態(tài)發(fā)生、心肌凋亡、心臟傳導和心肌細胞膜電位變化等。更重要的是，還有一些靶基因可以調控轉錄過程，如Rxrb、Rbp4、Prickle1、Epo、Foxs1、Srf。值得一提的是，目前雖鮮有關于miR-6315、miR-6324 以及新預測 rno-miR-n106、rno-miR-n019、rno-miR-n096、rnomiR-n096 調控心臟功能的相關文獻，但其靶基因Epo、Epor、Akap13、Gja1、Ltk、Srf、Camk2a 等對心肌功能的影響已得到實驗驗證。如王小雯（2009）發(fā)現(xiàn)，Epo 及其受體Epor 對急性心肌梗死大鼠心肌具有保護作用；Johnson 等（2015）發(fā)現(xiàn)，Akap13 通過Akap13-PKD1 信號途徑調控心肌收縮、細胞凋亡和代謝通路的轉錄過程，進而誘導心肌代償性肥大；初霞（2010）發(fā)現(xiàn)，Gja1 及其靶蛋白的下調可誘導心律失常的出現(xiàn)；Honda 等（1999）發(fā)現(xiàn)，心臟中Ltk 的激活可導致心臟肥大、心肌細胞變性；Shan 等（2010）發(fā)現(xiàn)，Srf 參與了miR-1、miR-206 在糖尿病型心臟病心肌中上調表達，引起心肌凋亡的過程；Guilbert 等（2015）發(fā)現(xiàn)，Camk2a 及其編碼蛋白參與了心肌舒張的調控過程。與以往報道的參與運動響應的miRNA 一致的是，響應間歇運動的心臟miRNA 靶基因也主要涉及心肌生長、增殖、凋亡、收縮等生理過程，但本研究發(fā)現(xiàn)，有些靶基因還與心臟傳導、膜電位變化以及轉錄的調控有關，另外，差異表達miRNA 與其靶基因之間還存在著“一對多”“多對一”的不同的調控關系，這些都說明，miRNA 影響心臟功能的基因表達調控機制可能非常復雜。不同miRNA交叉調控不同基因表達的機制，是miRNA 研究的一個重要方向。

表8 心臟miRNA 響應高強度間歇游泳運動的作用類型Table 8 Types of Cardiac miRNAs Response to HIST

3.3 心臟響應高強度間歇運動的調控通路分析

通過對差異表達miRNA 的靶基因進行GO 分析發(fā)現(xiàn)，這些基因涉及細胞的生長、代謝、應激、調節(jié)、免疫、細胞生理、細胞膜、細胞器和細胞外基質、催化活性、轉運活性、酶調節(jié)活性及結合活性等，幾乎涉及心肌細胞結構與功能的各個方面。

心臟響應高強度間歇運動有賴于miRNA 的靶基因及其編碼蛋白對多種代謝通路的激活或抑制，實現(xiàn)對心臟廣泛功能的調控。通過對KEGG 的注釋結果進行分類后發(fā)現(xiàn)，靶基因參與多條代謝通路，其中包括已有文獻報道的與運動心臟重塑密切相關的腎素-血管緊張素系統(tǒng)、MAPK 通路、Hippo 通路、PI3K-Akt 信號通路、PPAR 信號通路、AMPK 信號通路、胰島素信號傳導通路、p53 信號通路、內質網(wǎng)通路、cGMP-PKG 信號通路以及病毒性心肌炎炎癥通路等，這些通路分別涉及細胞凋亡、炎癥反應、心肌纖維化、心臟血管再生、細胞增殖、心肌細胞肥大等生理過程（劉明 等,2012；馬繼政 等,2010；馬智超,2013；徐同毅,2014；趙永才,2012；Gabriel et al.,2016；Ito et al.,2016；Li et al.,2016；Ma et al.,2015；Santos et al.,2016；Xu et al.,2016；Zhao et al.,2016）。其中，病毒性心肌炎炎癥通路、cGMP-PKG 通路是本研究中發(fā)現(xiàn)的富集程度最高的兩個通路。以上多數(shù)通路在心臟重塑方面的作用機制已被前人研究所揭示，為本研究解釋HIST 引起心臟miRNA 差異表達的可能調控通路提供了重要參考（表9）。

表9 心臟miRNA 響應高強度間歇游泳運動的變化Table 9 Changes of Cardiac miRNAs Response to HIST

該結果還提示了一些其他的代謝通路，如mRNA 監(jiān)控通路等，雖然目前鮮有相關研究證實這些信號通路與運動心臟重塑有直接關聯(lián)，但本研究提示，某些差異表達的miRNA 可能通過這些通路參與心臟miRNA 對間歇運動的遺傳應答過程。將miRNA 及其靶基因差異表達情況與心肌生理功能變化結合起來，可以更好地揭示心臟響應高強度間歇運動的生理機制。

4 結論

高強度間歇運動導致大鼠心肌miRNA 出現(xiàn)顯著性差異表達，影響心肌增殖、凋亡、收縮、心臟傳導及轉錄等多種生理功能，從而實現(xiàn)對運動心臟重塑的調控作用；差異表達miRNA 與其靶基因之間存在著復雜的調控機制，并且這種調控作用既有良性的，也有致病性的；這些miRNA 通過靶基因及其編碼蛋白參與PI3K-Akt 通路、mTOR 通路、MAPK 通路、VEGF 通路以及炎癥反應相關通路等多種信號通路的調控，可作為心臟響應間歇運動的生物標志物，進一步鑒定、驗證其功能，可以為間歇訓練計劃的優(yōu)化和運動風險的監(jiān)測提供重要參考，具有潛在的應用價值。