呂桂云 郭紹貴 張海英 耿麗華 宋鳳鳴 費(fèi)章君 許勇
目的與意義:西瓜是世界上最重要的蔬菜作物之一,約占世界蔬菜生產(chǎn)總面積的6%。由土壤傳播的真菌病原體半知菌亞門(mén)鐮孢屬尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum f.sp. niveurn)引起的枯萎病,是西瓜最具破壞性的疾病。通過(guò)基因表達(dá)圖譜分析西瓜與枯萎病菌非親和互作的分子機(jī)制,揭示出西瓜與枯萎病菌非親和互作中所涉及的基因,初步了解了西瓜與枯萎病菌非親和互作過(guò)程中基因表達(dá)信息。為西瓜抗枯萎病育種和病害防治奠定理論基礎(chǔ)。
材料與方法:采用代表8 000多個(gè)轉(zhuǎn)錄本的Agilent公司寡核苷酸的西瓜表達(dá)譜芯片,研究FON感染后抗性品系不同階段西瓜的基因表達(dá)變化。使用定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)進(jìn)一步研究西瓜和FON非親和互作中茉莉酸(JA)和莽草酸-苯丙烷-木質(zhì)素生物合成途徑中的基因的表達(dá)模式。利用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記FON1,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察病原菌在西瓜根系的附著、侵染和定殖等過(guò)程。
結(jié)果與分析:轉(zhuǎn)錄組分析中,我們鑒定了大量屬于編碼AP2/ERF,WRKY和MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子的基因,并發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)在FON1感染后顯著改變。已經(jīng)證明ERF轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用,與一些ERF基因的差異表達(dá)一致,F(xiàn)ON1感染還上調(diào)了許多參與乙烯生物合成的基因。觀(guān)察到不同的MYB基因在FON1感染后,西瓜中顯示出不同的表達(dá)模式。一個(gè)MYB基因WMU2748類(lèi)似于來(lái)自煙草由傷口和誘導(dǎo)子誘導(dǎo)并且能夠正調(diào)節(jié)發(fā)病相關(guān)的基因表達(dá),但MYB轉(zhuǎn)錄因子的另外2個(gè)同源物被抑制。這些結(jié)果表明,不同的MYB轉(zhuǎn)錄因子可能在FON1感染后發(fā)揮不同的功能。研究中,F(xiàn)ON1誘導(dǎo)WRKY轉(zhuǎn)錄因子(08042807T_5_33_A05)的表達(dá),進(jìn)一步支持WRKY基因似乎是響應(yīng)病原體的植物防御的一般調(diào)節(jié)劑。在該研究中,纖維素和半纖維素相關(guān)基因的同源物由FON1感染誘導(dǎo)。這些多糖被認(rèn)為在感染部位起物理強(qiáng)化作用。另一方面,莽草酸-苯丙烷-木質(zhì)素生物合成途徑中的基因表達(dá)在感染(3 dpi)的后期誘導(dǎo),但在非親和互作中沒(méi)有變化或被抑制。這與先前的報(bào)道一致,即西瓜根的木質(zhì)素含量明顯高于西瓜和FON之間的親和互作作用。在小麥-Pst病理系統(tǒng)中,參與木質(zhì)素生物合成的酶在24 hpi被誘導(dǎo),并在48 hpi達(dá)到峰值,在感染的早期(3 dpi)和晚期(5 dpi)階段誘導(dǎo)了一組包括PAL、4CL、CHS、CHR的基因。木質(zhì)素的生物合成被確定為感染枯萎病棉花的潛在防御反應(yīng)。這些結(jié)果表明,木質(zhì)化似乎也是宿主-病原體相互作用的后期(2~8 dpi)階段的主動(dòng)抗性機(jī)制。編碼參與ROS的許多基因在FON1感染西瓜中被激活。這與先前的觀(guān)察結(jié)果一致,即在枯萎真菌病原體感染后,發(fā)現(xiàn)許多氧化應(yīng)激相關(guān)基因在棉花和黃瓜中差異表達(dá)。ROS不僅可作為過(guò)敏性細(xì)胞死亡的局部信號(hào),還可作為誘導(dǎo)防御基因的第二信使。在FON1感染的西瓜根中與ROS產(chǎn)生相關(guān)的基因的差異表達(dá)表明ROS也可能參與西瓜和FON1之間的非親和互作作用。然而,這種假設(shè)需要通過(guò)測(cè)量感染FON后西瓜根中ROS的變化來(lái)進(jìn)一步檢驗(yàn)。在抗性西瓜系中,與易感植株相比,大多數(shù)JA生物合成基因被強(qiáng)烈誘導(dǎo)并且表達(dá)水平保持更長(zhǎng)。結(jié)果顯示,誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間是感染的早期(4-12hpi)階段。這些結(jié)果表明,JA在宿主-病原體相互作用的防御反應(yīng)中的作用。由于西瓜和FON1之間非親和互作所涉及的大多數(shù)分子機(jī)制尚未確定,因此,本研究中鑒定的大量基因?qū)⒆鳛檫M(jìn)一步研究的候選者。
結(jié)? ? 論:通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析,共篩選出679個(gè)上調(diào)基因和708個(gè)下調(diào)基因。包括轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)/調(diào)節(jié)基因、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、細(xì)胞壁修飾基因、氧爆發(fā)相關(guān)的基因和防衛(wèi)基因等。早期多是調(diào)控類(lèi)的基因如轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶等信號(hào)調(diào)控基因,在接種后期5~8 dpi多是些有實(shí)際作用的代謝途徑中的蛋白和酶,且基因的表達(dá)多是瞬時(shí)的,很少是持續(xù)性。驗(yàn)證了JA和木質(zhì)素生物合成途徑在西瓜與枯萎病菌的互作過(guò)程起重要作用,JA在西瓜與枯萎病菌互作早期起作用,木質(zhì)素則相對(duì)在晚期。由于西瓜和FON1之間非親和互作所涉及的大多數(shù)分子機(jī)制尚未確定,因此本研究中鑒定的大量基因?qū)⒆鳛檫M(jìn)一步研究的候選者。