李蘋芳 任潤生 姚協(xié)豐 徐錦華 羊杏平

目的與意義： 蔓枯病（Didymella bryoniae）是瓜類作物最重要的真菌性病害之一。近年來，隨著華東地區(qū)西瓜甜瓜種植面積的逐步擴(kuò)大，種植也大面積重茬，致使各西瓜甜瓜種植區(qū)蔓枯病危害也逐年加重，嚴(yán)重制約了西瓜甜瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本文對(duì)來源于華東地區(qū)不同種植區(qū)的西瓜和甜瓜蔓枯病病株上分離純化得到的蔓枯病原菌，通過從菌落形態(tài)、致病性、菌絲生長速度及產(chǎn)孢能力等生物學(xué)特性進(jìn)行觀察和對(duì)病原菌的ITS序列進(jìn)行了分析，進(jìn)而對(duì)蔓枯病菌株進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并嘗試建立蔓枯病菌產(chǎn)孢體系和穩(wěn)定有效的蔓枯病菌致病鑒定體系。

材料與方法： （1）對(duì)不同地區(qū)采集的發(fā)病組織在其病健交界處剪取4～5 cm長的組織，消毒后將組織塊置于PDA平板培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)后挑取邊緣菌絲進(jìn)行純化。純化后將分離的菌株接種新鮮黃瓜果皮進(jìn)行分生孢子的誘導(dǎo)和形態(tài)鑒定。（2）病原菌致病力鑒定材料采用‘Sugarlee‘Sugarbaby‘Charleston3個(gè)西瓜品種，及‘通甜和‘珍珠2個(gè)甜瓜品種。在植株2片真葉時(shí)，采用孢子懸浮液（1×106CFU·mL-1）進(jìn)行噴施接種，接種后覆蓋棚膜保濕3 d，溫度控制在25 ℃左右。于接種后1周采用九級(jí)病級(jí)法進(jìn)行葉片發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)。（3）采用rDNA-ITS擴(kuò)增引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3′）進(jìn)行病原菌核糖體RNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA- ITS）序列的擴(kuò)增和測(cè)序。將測(cè)得的病菌rDNA-ITS序列在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，搜索同源性序列，進(jìn)而根據(jù)本試驗(yàn)菌株與GenBank中已鑒定菌株ITS序列的相似度，初步確定蔓枯病菌種類。此外，采用DNA star對(duì)蔓枯病菌的ITS序列進(jìn)行比較，分析菌株間多態(tài)性。

結(jié)果與分析： （1）從中國華東地區(qū)收集的41個(gè)分離菌株，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，所有分離菌株的基板菌絲體初為乳白色，但在4 °C下轉(zhuǎn)移至黑暗時(shí)，基板菌絲體變?yōu)殚蠙炀G或黑色同心圓，氣生菌絲發(fā)達(dá)。從菌落、氣生菌絲看沒有明顯的差異;后期基內(nèi)菌絲形態(tài)略有差異。菌絲生長速度顯示出差異性，生長最快的JSHM-1達(dá)到1.87 cm·d-1，JSDY-1，JSDY-5，JSDY-6生長速度較慢，每天只有1 cm左右。（2）接種黃瓜果實(shí)后，大約1周后，在接種塊周圍可產(chǎn)生大量黑色的分子孢子器，通過顯微觀察，各菌系產(chǎn)生的孢子大小、形態(tài)基本一致為橢球型（花生豆形狀），以無色單胞或者雙胞為主，雙胞的2個(gè)細(xì)胞大小相等，分子孢子的平均長度和寬度大約為8 μm×3 μm，分子孢子的中間有輕微皺縮。（3）為了比較不同菌株的致病性差異，以西瓜感病材料‘Sugarlee‘Sugarbaby‘Charleston，及甜瓜感病材料‘通甜、中抗蔓枯病材料‘珍珠為試材進(jìn)行蔓枯病菌致病力測(cè)定，每個(gè)材料接種10棵，3次重復(fù)，1周后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，采用10級(jí)病情分級(jí)統(tǒng)計(jì)。綜合5個(gè)品種發(fā)病情況看，JXJJ-2，ZJNB-1，ZJNB-4，ZJNB-9，ZJNB-11，JSJY-2，JSJY-3，JSJY-4，JSJY-7，JSHM-1，JSHM-3，JSLH-1 12個(gè)菌株致病力較強(qiáng)，5個(gè)品種的病情等級(jí)均達(dá)到5以上。（4）為了進(jìn)一步確認(rèn)這些分離菌株為D. bryonia并揭示這些分離株之間的遺傳差異，通過引物對(duì)ITS1和ITS4（Genbank注冊(cè)號(hào)分別為KF38671和KF386611）對(duì)這些菌株的rDNA-ITS核苷酸序列（長度為545 bp）進(jìn)行了分析。擴(kuò)增產(chǎn)物的多重序列比對(duì)分析顯示，除了從浙江寧波和江蘇江陰分離出的13株甜瓜蔓枯菌株，其余菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的D. bryoniae分離株有99%～100%的一致性。13個(gè)菌株與其余菌株的區(qū)別為在ITS-1區(qū)131位由鳥嘌呤替換為腺嘌呤的單核苷酸替換。通過和前人對(duì)蔓枯病原菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果比較，本研究所分離的蔓枯病菌屬于D. Bryonia RG I或RG II。通過結(jié)合其他Didymella種（包括D. Zeae Maydis、D. Exigua、D. Rabiei、D. Fabae和D. Applanata）的聚類分析，進(jìn)一步確定本研究分離的蔓枯病菌株為D. bryoniae。

結(jié)? ? 論： 本研究對(duì)來自中國華東地區(qū)不同西瓜甜瓜寄主的GSB病原菌的鑒定和分析結(jié)果，將有助于我們?cè)谖磥砜赏ㄟ^選擇具有較高致病性的蔓枯病菌株進(jìn)行西瓜甜瓜品種的抗性評(píng)價(jià)和抗病育種實(shí)踐中。