梅娟娟 利桂河 黃偉華

[摘要]目的 探討富含絲氨酸-精氨酸剪接因子6（SRSF6）在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的表達(dá)及意義。方法 選取2013年1月～2017年1月我院收治的75例NSCLC患者作為研究對(duì)象，按照取材的不同分為非小細(xì)胞肺癌組織與相應(yīng)癌旁組織，采用免疫組化SP法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織與相應(yīng)癌旁組織中的SRSF6蛋白表達(dá)水平，同時(shí)分析SRSF6表達(dá)與NSCLC患者性別、年齡、臨床分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度之間的關(guān)系。結(jié)果 SRSF6在NSCLC組織中的陽(yáng)性表達(dá)為（1.65±0.48）%，明顯高于癌旁組織的（0.57±0.23）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;調(diào)查SRSF6與NSCLC患者臨床參數(shù)的關(guān)系，并根據(jù)肺癌組織中的SRSF6表達(dá)強(qiáng)度分為-、+、++、+++四組，發(fā)現(xiàn)SRSF6表達(dá)與NSCLC患者年齡和性別無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與臨床分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 SRSF6在癌旁組織中表達(dá)較少，在NSCLC中高表達(dá)，為NSCLC的臨床診斷和治療提供理論依據(jù)，有助于為臨床治療提供新思路。

[關(guān)鍵詞]富含絲氨酸-精氨酸剪接因子;非小細(xì)胞肺癌;生存率;臨床特征

[中圖分類號(hào)] R734.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）6（a）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of serine/arginine-rich splicing factor 6 （SRSF6） in non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods Seventy-five patients with NSCLC admitted to our hospital from January 2013 to January 2017 were selected as the study subjects and divided into non-small cell lung cancer （NSCLC） tissues and corresponding adjacent tissues according to the different samples， the expression of SRSF6 in non-small cell lung cancer （NSCLC） and its adjacent tissues was detected by immunohistochemical SP method， the relationship between the expression of SRSF6 and gender， age， clinical stage， distant metastasis and differentiation of NSCLC was also analyzed. Results The positive expression of SRSF6 in NSCLC tissues was （1.65±0.48）%， which was significantly higher than （0.57±0.23）% in adjacent tissues， the difference was statistically significant （P<0.05）. To investigate the relationship between SRSF6 and clinical parameters of patients with NSCLC， and according to the expression intensity of SRSF6 in lung cancer tissues， SRSF6 was divided into four groups： -， +， ++， +++， it was found that SRSF6 expression was not related to age and sex of patients with NSCLC， and there was no significant difference （P>0.05）. There were significant differences in clinical stage， distant metastasis and differentiation， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion SRSF6 is less expressed in adjacent tissues and highly expressed in NSCLC， which provides a theoretical basis for clinical diagnosis and treatment of NSCLC， and helps to provide new ideas for clinical treatment.

[Key words] Serine/arginine-rich splicing factor; Non-small cell lung cancer; Survival rate; Clinical features

肺癌主要為兩種類型的病理分型，即小細(xì)胞癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。其中最常見的是NSCLC，占全部肺癌發(fā)病率的80%～85%[1]。盡管近年來(lái)我國(guó)醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展，但NSCLC的發(fā)病率和死亡率仍未受到明顯控制。目前肺癌的早期診斷仍存在缺陷和不足，導(dǎo)致臨床上僅有20%～25%的NSCLC可獲得早期診斷[2]。因此，通過(guò)研究肺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找準(zhǔn)確可靠的肺癌早期診斷和治療的標(biāo)志物，已成為臨床肺癌疾病亟待解決的問(wèn)題[3]。SR蛋白家族屬于富含絲氨酸-精氨酸的蛋白質(zhì)，在前體RNA的剪接中起著極其重要的作用，其中富含絲氨酸-精氨酸剪接因子6（SRSF6）作為SR蛋白家族的主要成員之一，在多種腫瘤中存在著拷貝數(shù)擴(kuò)增的現(xiàn)象[4-5]。本研究選取我院收治的75例NSCLC患者作為研究對(duì)象，切除患者癌組織及癌旁組織，采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)SRSF6表達(dá)，并分析SRSF6表達(dá)與NSCLC患者臨床參數(shù)的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2013年1月～2017年1月我院收治的75例NSCLC患者作為研究對(duì)象，按照取材的不同分為非小細(xì)胞肺癌組織與相應(yīng)癌旁組織。其中男48例，女27例;年齡35～78歲，平均（56.51±4.28）歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理或組織學(xué)確診為NSCLC，同時(shí)實(shí)施手術(shù)的患者;②對(duì)本研究知情同意者;③本研究已經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在凝血功能障礙、肝腎功能障礙等放化療禁忌證者;②妊娠或哺乳期患者;③臨床資料不完整者;④合并精神疾病患者;⑤伴有活動(dòng)性感染及其他腫瘤者。

1.2方法

收集相關(guān)病例及患者臨床參數(shù)，應(yīng)用免疫組化的方法對(duì)組織中SRSF6的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)方法如下。①術(shù)中分別取NSCLC組織及癌旁組織，以4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)70%、80%、90%、95%及無(wú)水乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。將脫水后石蠟包埋的組織塊經(jīng)切片機(jī)行5 μm切片，干烤半個(gè)小時(shí)后置于二甲苯脫蠟30 min，梯度乙醇脫水各10 min，純水洗5 min×2次，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，置于37℃ 3% H2O2中30 min消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，微波爐中抗原修復(fù)，冷卻至室溫，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，5% BSA 37℃孵育30 min，傾去不洗，滴加一抗后置于4℃濕盒過(guò)夜，復(fù)溫，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，滴加SABC 37℃ 孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，滴加IgG 37℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，DAB顯色，自來(lái)水沖洗終止顯色，蘇木素輕度復(fù)染，梯度乙醇水化，二甲苯透明，中性樹膠封片。免疫組化SP試劑盒（批號(hào)：SP-0023）和DAB顯色試劑盒（批號(hào)：PW017）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，儀器為萊卡全自動(dòng)免疫組化儀（徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司，型號(hào)：BOND-MAX）、萊卡光學(xué)顯微鏡（德國(guó)LeicaLASXCore）。

1.3觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

采用免疫組化法檢測(cè)NSCLC組織與相應(yīng)癌旁組織中的SRSF6陽(yáng)性表達(dá)，并進(jìn)行比較;同時(shí)分析SRSF6表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者性別、年齡、臨床分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度之間的關(guān)系。陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿呈淡黃色或棕黃色，陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)通過(guò)兩階段評(píng)分法進(jìn)行：在光學(xué)顯微鏡（400×）下，每個(gè)切片選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，總計(jì)500個(gè)。計(jì)算每個(gè)切片的陽(yáng)性細(xì)胞百分比：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%，0分;5%～<25%，1分;25%～<50%，2分;50%～<75%，3分;≥75%，4分。染色強(qiáng)度：淡黃色1分;棕黃色2分;棕褐色3分。兩者相加：0～1分為陰性（-）;>1～3分為弱陽(yáng)性（+）;>3～5分為中度陽(yáng)性（++）;>5～7分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）[6-7]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn);多因素分析采用Logistic回歸分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1免疫組化法檢測(cè)SRSF6在癌旁組織及NSCLC組織中的陽(yáng)性表達(dá)

SRSF6在NSCLC組織和癌旁組織中均有表達(dá)。在NSCLC原發(fā)灶組織中SRSF6一般呈彌漫性、失極性表達(dá)，染色的程度增高，且大部分位于細(xì)胞膜與細(xì)胞漿中;在癌旁組織中僅在遠(yuǎn)曲小管與集合管細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞漿中存在表達(dá)，染色的強(qiáng)度為弱陽(yáng)性（圖1）。SRSF6在NSCLC癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)為（1.65±0.48）%，明顯高于癌旁組織的（0.57±0.23）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 SRSF6表達(dá)與NSCLC患者臨床參數(shù)的關(guān)系

根據(jù)肺癌組織中的SRSF6表達(dá)強(qiáng)度分為-、+、++、+++四組，SRSF6表達(dá)與NSCLC患者年齡和性別無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與臨床分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3 SRSF6表達(dá)與NSCLC患者相關(guān)指標(biāo)的多因素分析

SRSF6表達(dá)與NSCLC患者的臨床分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

3討論

近年來(lái)，隨著手術(shù)改進(jìn)和麻醉技術(shù)的不斷發(fā)展與創(chuàng)新以及新型化療藥物的不斷問(wèn)世，肺癌的綜合治療技術(shù)已逐漸成熟，但在過(guò)去的50年中，肺癌的5年生存率并未得到顯著提高，肺癌的死亡率在5年內(nèi)仍高達(dá)85%[8]。相關(guān)研究提出，若能有效提高肺癌的早期診斷，可明顯改善肺癌的治療和預(yù)后效果[9]。目前，經(jīng)過(guò)多年肺癌的診斷和治療經(jīng)驗(yàn)以及肺癌相關(guān)研究的進(jìn)展，逐漸形成了結(jié)構(gòu)圖像、功能影像學(xué)檢查、痰細(xì)胞學(xué)、內(nèi)鏡檢查、臨床癥狀性肺癌的診斷模型，最終以組織病理學(xué)檢查為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，可有效調(diào)節(jié)和指導(dǎo)肺癌的診斷和治療，提高肺癌的診治水平[10-12]。然而，目前對(duì)于無(wú)癥狀肺癌，仍缺乏有效的早期診斷方法，這是目前導(dǎo)致肺癌死亡的主要原因[13]。因此，臨床將早期NSCLC地診斷及預(yù)后評(píng)估作為NSCLC防治的重要內(nèi)容。SR蛋白家族屬于絲氨酸-精氨酸富集蛋白，其在前體RNA的剪接過(guò)程中發(fā)揮著極為重要的作用，SR蛋白能夠識(shí)別結(jié)合前體RNA上的剪接元件，繼而招募組裝剪接體，促進(jìn)或抑制剪接事件的發(fā)生[14-15]。腫瘤中，SR蛋白的異常表達(dá)導(dǎo)致RNA異常剪接，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移，抑制腫瘤的凋亡。近期報(bào)道[16]，作為經(jīng)典的SR蛋白，剪接因子SRSF6屬于一個(gè)癌基因，能夠調(diào)控大量的下游基因發(fā)生異常的可變剪接，在廣泛的腫瘤相關(guān)機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。此外，其他的SR蛋白家族成員也與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展存在著密不可分的聯(lián)系。例如，SRSF6在肝癌中高表迗，并且與腫瘤的進(jìn)程相關(guān);在結(jié)腸癌以及卵巢癌中，高表迖的SRSF6與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及生長(zhǎng)相關(guān);SRSF6被報(bào)道與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）兩種不同功能的轉(zhuǎn)錄本（促血管生成轉(zhuǎn)錄本VEGF165以及抑血管生成轉(zhuǎn)錄本VEGF165）表達(dá)相關(guān)。以上結(jié)果提示SR蛋白可以作為腫瘤的重要的檢測(cè)指標(biāo)。

SRSF6作為SR蛋白家族的主要成員之一，在皮膚癌中，高表達(dá)水平SRSF6能夠?qū)е录?xì)胞黏合素C（TNC）基因的異?？勺兗艚樱瑥亩龠M(jìn)皮膚癌的增殖[17]。谷雪梅等[18]在結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，SRSF6在結(jié)直腸癌高表達(dá)，并通過(guò)調(diào)控ZO-1的表達(dá)，影響癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響結(jié)直腸癌的治療效果及預(yù)后。本研究進(jìn)一步調(diào)查SRSF6在NSCLC中的表達(dá)及意義顯示，SRSF6在NSCLC原發(fā)灶組織中彌漫性高表達(dá)，在癌旁肺組織中低表達(dá);調(diào)查SRSF6與NSCLC患者臨床參數(shù)的關(guān)系，并根據(jù)肺癌組織中的SRSF6表達(dá)強(qiáng)度分為-、+、++、+++四組，發(fā)現(xiàn)SRSF6表達(dá)與NSCLC患者的年齡和性別無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與臨床分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及中高分化是SRSF6陽(yáng)性表達(dá)的主要影響因素。檢測(cè)SRSF6的表達(dá)對(duì)于評(píng)估肺癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)行為具有一定的參考價(jià)值，在評(píng)估手術(shù)預(yù)后時(shí)將腫瘤分化程度與SRSF6表達(dá)強(qiáng)度相互結(jié)合，可能會(huì)達(dá)到更好的評(píng)估效果。

綜上所述，SRSF6在癌旁組織中表達(dá)較少，在NSCLC中高表達(dá)，為NSCLC的臨床診斷和治療提供理論依據(jù)，有助于為臨床治療提供新思路。

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（收稿日期：2019-01-22? 本文編輯：劉克明）