王 碩，李雁冰，黃大鵬，李井春，魏國生

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

目前豬人工授精技術(shù)中的精液長期保存被廣泛重視[1]。常溫保存為豬精液的主要保存方式，可利用時間一般只有3 d[1]，易造成資源浪費。相對于其他畜禽，豬冷凍精的技術(shù)應(yīng)用較少[2]，4℃保存不僅保存時間較長且對豬精子損傷較小，研究精液4℃保存具有重要意義。

豬精子在低溫易引起“冷休克”[3]，因此抗低溫保護劑的選擇尤為重要。保護劑可結(jié)合細胞內(nèi)外的水，使液態(tài)環(huán)境黏性上升，降低溶液中電解質(zhì)的濃度和滲透壓等作用[4-5]，達到保護精子的目的。甘油是廣泛應(yīng)用的冷凍保護劑，但具有一定毒性。Sánchez-partida 等[6]研究表明，有甘油的稀釋液中精子運動性比沒有甘油更好。乙二醇活性較強，在一定條件下易產(chǎn)生酸類，造成精子損傷，而甘油較穩(wěn)定。孫時軍等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在4℃下采用1%乙二醇對精子活率的保護效果最好。本實驗在Modena 基液中添加不同比例的乙二醇和甘油，同時采用負壓處理，通過檢測精子活率、直線速度、路徑速度、畸形率、鞭打頻率參數(shù)，探究組合劑對精液的保存效果，為豬精液的4℃保存研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 甘油（吉林省軍區(qū)化工廠生產(chǎn)）；乙二醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)）；每1 升Modena 稀釋液中含：葡萄糖 27.50 g；NaHCO31 g；TRIS 5.65 g；檸檬酸 2.9 g；檸檬酸鈉 6.9 g；EDTA-2Na 2.6 g；青霉素 0.074 g；鏈霉素 0.05 g；BSA 4 g。Modena 稀釋液藥品成分均購自西格瑪公司。

1.2 精液來源 豬精液采自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)豬場，采集3 頭健康無病長白種公豬混合精液，年齡為2～3 歲。無異味、色澤為乳白色、精子活力在0.7 以上的精液。

1.3 實驗設(shè)計 將稀釋后精液分成6 組，添加抗凍劑分 別 為0.00%+0.00%（ 對 照 組）、0.50%+0.50%、0.75%+0.25%、0.25%+0.75%、0.00%+1.00%、1.00%+0.00%的甘油和乙二醇，每組設(shè)3 個重復(fù)實驗，各組稀釋液有效羥基含量分別為0.00×10-2、3.13×10-2、22.77×10-2、27.10×10-2、36.13×10-2、42.40×10-2mol/L。檢測不同保存時間段的精子質(zhì)量參數(shù)。

1.4 實驗方法

1.4.1 豬精液的稀釋 原精液采集后1～2 h 內(nèi)運輸?shù)綄嶒炇?，采用精板計?shù)法檢測原精液的精子密度，用添加乙二醇和甘油的Modena 基礎(chǔ)稀釋液進行稀釋，稀釋后密度為1×108個/mL。

1.4.2 精液4℃保存處理 將稀釋后的各組放入負壓瓶中，通過真空泵將其壓強調(diào)整至負壓 0.04 MPa，用數(shù)層紗布包裹，轉(zhuǎn)入17℃的恒溫箱內(nèi)降溫平衡1.5 h，再轉(zhuǎn)入4℃恒溫箱內(nèi)，降溫過程平穩(wěn)緩慢。每隔12 h 對精液緩慢混勻，避免精子沉聚而損傷。

1.4.3 精子質(zhì)量參數(shù)的檢測 根據(jù)實驗設(shè)計，在保存的各時間段（1、3、5、7、9、11、13 d）定時取樣，樣品需在37℃培養(yǎng)箱中復(fù)蘇15 min，通過邁朗全自動精子分析儀檢測精子活率、路徑速度、直線速度、鞭打頻率、畸形率等質(zhì)量參數(shù)，并記錄實驗數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計分析 利用 StatView 5.0 軟件對實驗測定的各項參數(shù)進行方差分析和多重比較，實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。P＜0.05 為差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同抗凍劑配合對精子活率的影響 由表1 可知，隨著保存天數(shù)的增加，各組精子活率呈逐漸下降趨勢。相對于實驗組，對照組精子活率的下降速度較快，1 d 后精子活率低于其他組（P＜0.05）。保存13 d 時僅0.25%+0.75%、1.00%+0.00%組精子有活率，其中，1.00%+0.00%組精子活率在9～13 d 高于除0.25%+0.75%之外的3 個實驗組（P＜0.05）；5 個實驗組中，0.25%+0.75% 組在9～13 d的精子活率高于0.50%+0.50% 組和0.75%+0.25% 組（P＜0.05）；0.75%+0.25%組在保存9～11 d 的精子活率高于0.50%+0.50%組（P＜0.05）。精子活率基本符合“有效羥基”含量越高保存效果越好的原理。

2.2 不同抗凍劑配合對精子路徑速度的影響 由表2 知，對照組1 d 后精子路徑速度大幅度下降，且顯著低于各實驗組，而各實驗組下降速度緩慢。1.00%+0.00%組在1～13 d的精子路徑速度高于其他組（P＜0.05）。在實驗組中，0.25%+0.75%組在7～13 d 的精子路徑速度高于0.50%+0.50%、0.75%+0.25% 組（P＜0.05）；0.75%+0.25%、0.00%+1.00%組在7～11 d高于0.50%+0.50%組（P＜0.05），但兩者無顯著差異；0.25%+0.75% 組在11～13 d 高于0.00%+1.00% 組（P＜0.05），且13 d 時0.00%+1.00%組無速度。

表1 不同抗凍劑配合對精子活率的影響 %

表2 不同抗凍劑配合對精子路徑速度的影響 μm/s

2.3 不同抗凍劑配合對精子直線速度的影響 由表3知，對照組的直線速度在1 d 后就大幅度下降，且低于各實驗組（P＜0.05）。1.00%+0.00% 組在1～13 d 的直線速度高于其他各組（P＜0.05），且在13 d 時仍有速度。5 個實驗組中，0.25%+0.75% 組在9～13 d 的直線速度高于0.50%+0.50%、0.75%+0.25%組（P＜0.05）；0.75%+0.25%組在7～11 d高于0.50%+0.50%組（P＜0.05），且這2 組13 d 時都無速度；0.25%+0.75%組在11～13 d高于0.00%+1.00% 組（P＜0.05）。0.00%+1.00% 組 在5～11 d 高于0.50%+0.50% 組（P＜0.05），在9～11 d 高于0.75%+0.25%組（P＜0.05）。

2.4 不同抗凍劑配合對精子畸形率的影響 由表4 可知，各組精子畸形率隨著保存天數(shù)的增加呈逐漸上升趨勢。其中，對照組在2～11 d 的畸形率高于各實驗組（P＜0.05）。5 個實驗組中，1.00%+0.00%組在11～13 d 的精子畸形率低于其他實驗組（P＜0.05）；0.00%+1.00%組在3～13 d低于0.50%+0.50%、0.75%+0.25%組（P＜0.05），0.75%+0.25%組在11～13 d 低于0.50%+0.50%組（P＜0.05）；0.00%+1.00%組在9～13 d 低于0.50%+0.50%、0.25%+0.75%組（P＜0.05），而0.25%+0.75%組在3～13 d 低于0.00%+1.00%組（P＜0.05）。

2.5 不同抗凍劑配合對精子鞭打頻率的影響 由表5可知, 各組精子鞭打頻率隨著保存天數(shù)的增加呈逐漸下降趨勢。對照組的鞭打頻率從1 d 后低于各實驗組（P＜0.05）。5 個實驗組中，0.50%+0.50%、0.75%+0.25%組間的鞭打頻率差異不顯著；0.00%+1.00%組在9～13 d低于0.25%+0.75%、1.00%+0.00%組（P＜0.05）；1.00%+0.00%組在13 d 高于0.25%+0.75%組（P＜0.05）。

表3 不同抗凍劑配合對精子直線速度的影響 μm/s

表4 不同抗凍劑配合對精子畸形率的影響 %

表5 不同抗凍劑配合對精子鞭打頻率的影響 HZ

3 討 論

本實驗采用負壓處理，可有效降低精液內(nèi)的含氧量，減緩精子代謝過程，也可抑制微生物的滋生，從而降低對精子的損傷以及疾病的傳播。由于乙二醇活性較強，低氧環(huán)境可減緩乙二醇的變質(zhì)過程，可減少酸類物質(zhì)對精子的損傷。

本實驗選用的Modena稀釋液對精液保存效果良好[8-9]。甘油與乙二醇是良好的抗凍劑，最初是Polge 等[10]發(fā)現(xiàn)甘油對牛精子具有抗凍保護作用，以此家畜精液長期保存技術(shù)有了重大突破。保護劑的羥基與水之間以氫鍵的形式鍵合，使溶液粘稠度升高，同時保護劑可以沖淡溶液中溶質(zhì)鹽濃度和滲入細胞內(nèi)，降低攝入精子的鹽量，調(diào)節(jié)胞內(nèi)過冷狀態(tài)，從而緩解細胞脫水皺縮的程度及速度[11]。本實驗結(jié)果表明，各項質(zhì)量參數(shù)均顯示0.25%甘油+0.75%乙二醇組的精子保存效果較好，但1%甘油組的保護效果優(yōu)于0.25% 甘油+0.75% 乙二醇組，0.25% 甘油+0.75% 乙二醇組優(yōu)于1% 乙二醇組，說明甘油與乙二醇不同比例組合會弱化保護作用，可能是2種保護劑分子鍵合所致。高才等[12]研究表明，甘油與乙二醇的羥基除了與水鍵合外，自身也有鍵合，從而會弱化與水鍵合的效果。溶液中“羥基濃度”近似相等時乙二醇的未結(jié)冰水略高于甘油，說明2 種保護劑在水溶液中有著復(fù)雜的溶質(zhì)與溶劑、溶劑與溶劑、溶質(zhì)與溶質(zhì)之間的相互作用，溶質(zhì)結(jié)合水的能力確實與溶質(zhì)中的羥基含量有定量的關(guān)系。根據(jù)相似相溶等原理分析推測，乙二醇與甘油首先鍵合會造成有效羥基量減少，從而弱化對精子的保護作用。本實驗中，0.25% 甘油+0.75%乙二醇組的有效羥基含量低于1%乙二醇組，在9 d 之后保存效果優(yōu)于1% 乙二醇組，從抗凍劑組成來看1%乙二醇組乙二醇含量高于0.25% 甘油+0.75% 乙二醇組，表明乙二醇活性較強，若保存不當(dāng)易產(chǎn)生酸類，造成精子損傷，而甘油較穩(wěn)定，pH 變化可能是0.25%甘油+0.75%乙二醇組保存效果顯著高于1%乙二醇組的原因。本實驗與孫時軍等[7]在7 d 時1%乙二醇組的精子活率優(yōu)于1%甘油組的結(jié)果不同，本實驗在7 d 時1%乙二醇組與1%甘油組的精子活率差異不顯著，7 d 后1%甘油組顯著優(yōu)于1%乙二醇組，并且直線速度指標(biāo)在1 d后1%甘油組顯著優(yōu)于1%乙二醇組。

甘油會導(dǎo)致胞體膜損傷和頂體膜的穿透能力改變。本實驗保護劑總濃度為1%，低于冷凍保存甘油含量對精子損傷較低。李青旺等[13]研究表明，乙二醇用于冷凍保護劑，精子尾部畸形較多，頂體較少，而甘油引起精子尾部畸形較少，頂體較多。曾維斌等[14]研究發(fā)現(xiàn)，將甘油與乙二醇組合使用既可保護冷凍精液中精子頂體又保護其尾部。本實驗中，1%乙二醇組的路徑速度與直線速度顯著低于1%甘油組，可能是乙二醇引起精子尾部異常所致。隨著處理時間的延長，部分精子的質(zhì)膜損傷，造成精子難以承受滲透壓變化，使細胞內(nèi)部機制ATP 供應(yīng)不足，致使精子運動形式變化和運動性能喪失[15]。

4 結(jié) 論

本實驗結(jié)果顯示，在精液基礎(chǔ)液中添加一定量的甘油和乙二醇在4℃負壓環(huán)境下可顯著提高豬精子的活率、路徑速度、直線速度、鞭打頻率，降低精子畸形率，其中，1% 甘油組對精液保存效果最好，0.25% 甘油+0.75%乙二醇組保存效果優(yōu)于其他組合組和1%乙二醇組，且甘油與乙二醇分子間有相互作用關(guān)系，如果按量因子，目前實驗可分析二者互作效應(yīng)。