宋 康， 曹雪鋒， 張軼凡， 噶 琴， 白振忠△， 格日力△

(1青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心， 2青海省人民醫(yī)院， 青海 西寧 810001)

青藏高原被稱為“世界屋脊”，平均海拔4 500 m,其氣候特征為低溫、低氧和低壓。高原鼠兔是青藏高原典型的土生小型嚙齒類哺乳動物，能夠很好地適應(yīng)高原環(huán)境[1]。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的代謝場所，代謝體內(nèi)的糖脂類物質(zhì)，產(chǎn)生 ATP和熱量，供機(jī)體能量的需求[2]。肝臟和骨骼肌含有大量的線粒體，同時也是糖脂代謝的場所。在不同低氧環(huán)境下高原鼠兔的肝臟和骨骼肌線粒體的呼吸功能的變化目前尚不清楚。本研究選取不同海拔高原鼠兔，觀察其肝臟和骨骼肌線粒體呼吸功能的變化，了解不同海拔高原鼠兔的線粒體的適應(yīng)特點。

材 料 和 方 法

1 動物

海拔4 300 m組的高原鼠兔(6只)捕捉于青海省果洛州瑪多縣星星海，捕捉季節(jié)為夏季；海拔2 900 m組的高原鼠兔(6只)捕捉于青海省垃脊山南麓，捕捉季節(jié)為夏季。2組高原鼠兔均為雄性，無性別差異。所有動物研究均符合中國衛(wèi)生部的管理規(guī)定，經(jīng)過青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

2 主要儀器及試劑

2.1儀器 高分辨線粒體呼吸測定儀和組織勻漿機(jī)購自O(shè)roboros；獸用全自動血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

2.2試劑 (1)MiR05呼吸液：110 mmol/L sucrose、60 mmol/L K-lactobionate、0.5 mmol/L EGTA、3 mmol/L MgCl2、20 mmol/L taurine、10 mmol/L K2H2PO4、 20 mmol/L HEPES和0.1% BSA[3]。(2)透化肌纖維原液(BIOPS)：10 mmol/L Ca-EGTA buffer、0.1 μmol/L free calcium、20 mmol/L imidazole、20 mmol/L taurine、50 mmol/L K-MES、0.5 mmol/L DTT、6.56 mmol/L MgCl2、5.77 mmo/L ATP、15 mmol/L phosphocreatine[4]。(3)過氧化氫測定校準(zhǔn)試劑(Sigma)。(4)氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)及脂肪酸氧化(fatty acid oxidative，F(xiàn)AO)試劑：丙酮酸鹽、谷氨酸鹽、蘋果酸、琥珀酸鹽、二磷酸腺苷、FCCP，魚藤酮、抗霉素A和細(xì)胞色素C均購自Sigma。

3 實驗方法

3.1取樣 2組鼠兔分別在捕獲地點進(jìn)行實驗。禁食12 h后給予2%戊巴苯妥鈉腹腔注射麻醉，迅速在冰上取出肝臟和骨骼肌組織。肝組織稱干重10 mg后放入 Shredder-Tube FT500-PS勻漿管中，加入預(yù)冷的MiR05呼吸液500 μL,進(jìn)行勻漿(勻漿機(jī)底座提前在4 ℃冰箱中放置24 h)，勻漿10 s。離心完畢后用吸液管將勻漿液轉(zhuǎn)移到Falcon管中，然后用吸液管吸取呼吸液沖洗勻漿管，將清洗的液體也加入Falcon管中，將Falcon定容到5 mL，放置冰上待用。骨骼肌組織選取后肢腓腸肌的白肌，分別稱干重各20 mg，一份20 mg骨骼肌組織用于勻漿(操作如上述肝組織)；另一份20 mg骨骼肌組織用于骨骼肌纖維透化。

3.2骨骼肌纖維透化 骨骼肌縱向切成20 mg的樣品，放入10 mL預(yù)冷BIOPS的培養(yǎng)皿中，使用尖銳的鑷子去除所有連接的結(jié)締組織，在冰上的培養(yǎng)皿中用鑷子分離纖維束，可通過觀察分離的纖維束從紅色變成淺色來評估分離程度。取5 mg 皂苷放入1 mL BIOPS中配制母液，取配制好的母液21 μL加入到預(yù)冷的2 mL BIOPS中配制成透化液。組織分離后，將纖維束放入預(yù)冷的配制好的2 mL透化液中。在冰上輕微振蕩30 min,后將纖維束從透化液中轉(zhuǎn)移到提前預(yù)冷的2 mL MiR05呼吸液中，在冰上溫和振蕩10 min。透化后，對肌纖維進(jìn)行稱重，取肌纖維并接觸濾紙5 s，同時用另一張濾紙擦去鑷子尖端的液體，從濾紙上取下樣品后，再次接觸干燥的濾紙區(qū)域，立即將纖維束放置在天平稱上的錫箔紙上稱量，取3 mg骨骼肌纖維，放入預(yù)冷的MiR05呼吸液中。

3.3肝臟及骨骼肌OXPHOS的測定方法 將方法3.1勻漿好的肝組織及方法3.2透化好的骨骼肌纖維組織分別加入提前校正好的高分辨線粒體呼吸測定儀倉內(nèi)，倉內(nèi)溫度37 ℃。依據(jù)底物-解偶聯(lián)劑-抑制劑-滴定法(substrate -uncopler-inhibitor-titration，SUIT)原則加入丙酮酸(5 mmol/L)、蘋果酸(5 mmol/L)、谷氨酸鈉(10 mmol/L)，待呼吸速率平穩(wěn)后，得到呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的態(tài)4呼吸速率(CI-LEAK)(骨骼肌纖維中不加入丙酮酸)。再次加入 ADP(10 mmol/L),可得到線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ態(tài)3呼吸速率(CI-OXPHOS)。滴定細(xì)胞色素C(10 μmol/L)，以確定線粒體膜的完整性，如加入細(xì)胞色素C后O2消耗量增加超過15%，表示線粒體膜破壞，數(shù)據(jù)被剔除。加入琥珀酸(10 mmol/L)激活線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ，呼吸速率平穩(wěn)后得到線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ的態(tài)3呼吸速率(CI+II-OXPHOS)，繼續(xù)滴定解偶聯(lián)劑FCCP(0.25～1.5 μmol/L)，獲得呼吸鏈復(fù)合物I和II的電子傳遞能力(CI+II-ETS)，滴定復(fù)合物Ⅰ的特異抑制劑魚藤酮(0.5 μmol/L)后，得到呼吸鏈復(fù)合物II的電子傳遞能力(CII-ETS)。

3.4肝臟及骨骼肌FAO的測定方法 脂肪酸滴定階段：滴定棕櫚酸肉堿和蘋果酸后，測定線粒體態(tài)4呼吸速率(FAO-LEAK)；之后滴定ADP，建立以棕櫚酸肉堿為底物的脂肪酸代謝通路態(tài)3呼吸速率(FAO-OXPHOS)。

3.5骨骼肌H2O2的檢測 選用綠色傳感器(525 nm)。安裝A、B兩倉綠色傳感器。將方法3.1勻漿好的骨骼肌組織加入提前校正好的高分辨線粒體呼吸測定儀倉內(nèi)。校正完畢后，待基線平穩(wěn)后，依據(jù)SUIT原則依次加入底物，解偶聯(lián)劑及抑制劑。方法同3.3骨骼肌OXPHOS滴定方法，此過程中不加入細(xì)胞色素C。

3.6肝臟及骨骼肌偶聯(lián)率(coupling efficiency)的測定方法 滴定ADP后測得的呼吸速率與ADP滴定前的呼吸速率兩者的差值與滴定ADP后測得的呼吸速率的比值為偶聯(lián)率。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 23.0及Graphpad Prism 6統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組高原鼠兔一般資料的比較

海拔4 300 m組的高原鼠兔血紅蛋白明顯低于海拔2 900 m的高原鼠兔(P<0.05)，見表1。

表1 不同海拔高原鼠兔一般資料的比較

*P<0.05vs4 300 m group.

2 兩組高原鼠兔肝臟和骨骼肌線粒體OXPHOS及FAO水平的比較

兩組肝臟線粒體的OXPHOS水平相比，2 900 m組的CI-LEAK、CI-OXPHOS、CI+II-OXPHOS、CI+II-ETS和CII-ETS均較4 300 m組升高，但偶聯(lián)率較4 300 m組低(P<0.05)；2組肝臟線粒體的FAO水平比較，2 900 m組的FAO-LEAK較4 300 m組高(P<0.05)，見圖1、表2。

兩組骨骼肌線粒體的OXPHOS水平相比，2 900 m組的CI-LEAK、CI+II-OXPHOS和CI+II-ETS較4 300 m組明顯升高(P<0.05)；2組骨骼肌的線粒體FAO水平比較，2 900 m組的FAO-LEAK和FAO-OXPHOS均較4 300 m組高(P<0.05)，見圖2、表3。

Figure 1. The mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and fatty acid oxidation (FAO) were showed for evaluating the change levels of oxygen consumption and O2flux determined by O2k-Fluorometry in pika liver homogenate using substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols.

圖1 肝臟線粒體OXPHOS 和FAO的氧耗率

Figure 2.The mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and fatty acid oxidation (FAO) were showed for evaluating the change levels of oxygen consumption and O2flux determined by O2k-Fluorometry in pika permeabilized muscle fibres using substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols.

圖2 骨骼肌線粒體OXPHOS 和FAO的氧耗率

表2 不同海拔肝臟線粒體OXPHOS及FAO的變化

Table 2.The changes of mitochondrial OXPHOS and FAO in the liver at different altitudes (Mean±SD.n=6)

Index4 300 m2 900 mCI-LEAK (nmol/g)7.90±1.23 17.90±2.59**CI-OXPHOS (nmol/g) 62.42±5.41 75.75±3.67*CI+II-OXPHOS (nmol/g) 87.00±10.77167.43±4.00**CI+II-ETS(nmol/g)102.28±14.30161.28±17.30*CII-ETS (nmol/g) 82.57±1.66138.39±10.61**Coupling efficiency0.87±0.020.76±0.04*FAO-LEAK (nmol/g)6.98±1.62 21.50±8.24*FAO-OXPHOS (nmol/g) 57.56±10.77 56.00±5.87

*P<0.05,**P<0.01vs4 300 m group.

表3 不同海拔骨骼肌線粒體OXPHOS及FAO的變化

Table 3.The changes of mitochondrial OXPHOS and FAO in the skeletal muscle at different altitudes (Mean±SD.n=6)

Index4 300 m2 900 mCI-LEAK (nmol/g)15.79±4.05 30.05±4.97*CI-OXPHOS(nmol/g)43.51±12.80 61.12±5.33CI+II-OXPHOS (nmol/g)87.34±12.14125.46±15.59*CI+II-ETS (nmol/g)83.62±4.88129.32±11.66**CII-ETS (nmol/g)59.13±3.80 96.66±23.58Coupling efficiency 0.62±0.11 0.47±0.09FAO-LEAK (nmol/g)13.35±3.45 35.36±3.86**FAO-LEAK (nmol/g)21.34±3.65 37.07±2.52**

*P<0.05,**P<0.01vs4 300 m group.

3 兩組骨骼肌線粒體H2O2的比較

在呼吸鏈復(fù)合物I的態(tài)4呼吸(LEAK)、復(fù)合物I的態(tài)3呼吸(OXPHOS)、復(fù)合體I+II的態(tài)3呼吸(OXPHOS*)和復(fù)合體I+II的電子傳遞(ETS)過程中，2 900 m組的ΔH2O2均較4 300 m組低(P<0.05)，見圖3～4。

Figure 3.Skeletal mitochondrial H2O2levels and H2O2flux of pika skeletal muscle homogenate were determined using substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols.

圖3 骨骼肌H2O2水平測定

討 論

O2是生物新陳代謝，維持生命活動不可缺少的物質(zhì)。線粒體是真核生物O2代謝的終末端。機(jī)體內(nèi)3大物質(zhì)糖、蛋白質(zhì)和脂肪的分解代謝最終在線粒體通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化過程被消耗，為機(jī)體提供能量。而肝臟和骨骼肌是3大營養(yǎng)物質(zhì)代謝的主要場所。同時線粒體是機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的主要部位，ROS增多可損傷線粒體的功能[5]。本研究選用低氧環(huán)境不同海拔同一季節(jié)下的土著生物高原鼠兔，對其肝臟及骨骼肌線粒體OXPHOS、FAO呼吸功能進(jìn)行測定，同時檢測骨骼肌H2O2的產(chǎn)生水平，了解不同海拔高原鼠兔線粒體的適應(yīng)特點。

Figure 4.H2O2flux corrected for minimal observed slope. The fluorescence signals were calibrated using the H2O2titrations at the corresponding state (see Figure 1). Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs4 300 m group.

圖4 2組ΔH2O2的變化

本研究通過檢測肝臟及骨骼肌線粒體OXPHOS水平發(fā)現(xiàn)，海拔4 300 m組高原鼠兔的肝臟和骨骼肌CI-LEAK水平均較海拔2 900 m組降低，海拔4 300 m組的肝臟及骨骼肌線粒體的偶聯(lián)率較2 900 m組高，考慮海拔4 300 m組的鼠兔能更有效利用氧氣。海拔4 300 m組肝臟線粒體CI-OXPHOS、CI+II-OXPHOS，骨骼肌線粒體CI+II-OXPHOS均較2 900 m組下降,其原因可能是在低氧環(huán)境下高原鼠兔經(jīng)過長期自然選擇，機(jī)體對齊對無氧呼吸的依賴性減弱，三羧酸循環(huán)反應(yīng)效率有所提高[6]。有文獻(xiàn)報道[7]，在一些高海拔低氧環(huán)境土著生物中，細(xì)胞線粒體數(shù)目減少，考慮原因可能是長期低氧環(huán)境選擇下機(jī)體會通過提高能量利用效率，減小體型等來減少機(jī)體能量消耗。

本研究提示海拔4 300 m組肝臟線粒體CI+II-ETS和CII-ETS及骨骼肌線粒體CI+II-ETS較2 900 m組降低，分析原因可能是在長期低氧環(huán)境下，糖酵解作用增強(qiáng)，丙酮酸更多地進(jìn)入無氧呼吸，三羧酸循環(huán)過程中產(chǎn)生的還原當(dāng)量減少，電子傳遞減少[8]。實驗發(fā)現(xiàn)肝臟及骨骼肌線粒體FAO-LEAK、骨骼肌FAO-OXPHOS在海拔4 300 m組較2 900 m組明顯降低，分析原因考慮脂肪酸氧化分解耗氧量大，低氧時線粒體內(nèi)膜上的肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶減少，內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域蛋白1刺激脂肪存儲，減弱脂肪酸分解代謝強(qiáng)度[9]。

線粒體呼吸鏈?zhǔn)羌?xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要來源[10]。正常情況下，細(xì)胞吸收的 O2絕大部分在線粒體呼吸鏈被還原生成水，但同時也有2%的氧可在呼吸鏈中途接受電子被部分還原生成超氧陰離子和H2O2。本研究發(fā)現(xiàn)，海拔4 300 m組骨骼肌線粒體LEAK、OXPHOS、OXPHOS*、ETS ΔH2O2較2 900 m組升高。分析考慮低氧下,低氧誘導(dǎo)因子1激活丙酮酸脫氫酶激酶基因和乳酸脫氫酶A基因，阻止丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)途徑，從而減少電子流的產(chǎn)生[8]。同時，低氧誘導(dǎo)因子通過調(diào)控線粒體呼吸鏈的效率提高電子的有效利用，減少電子泄漏，減少ROS的產(chǎn)生。

綜上所述，在低氧環(huán)境下，線粒體復(fù)合體I的態(tài)4呼吸速率更低，但偶聯(lián)率明顯增高，故考慮高原鼠兔能更好地利用氧氣，適應(yīng)低氧環(huán)境。脂肪酸代謝水平在低氧環(huán)境下受到抑制。長期低氧環(huán)境下，高原鼠兔ROS產(chǎn)量減少，從而保護(hù)線粒體功能。