李業(yè)盛， 凌振威， 陳慶梓， 吳佑森， 葉綺婷， 溫啟銳， 戴永亮， 李建華， 周麗芬△

(1廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心， 廣東省高校蛋白質(zhì)修飾與降解重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院第三臨床學(xué)院， 廣東 廣州 511436)

呼吸道疾病(如慢性阻塞性肺病、支氣管哮喘和過敏性鼻炎等)的患病率及死亡率逐年上升[1]，嚴(yán)重影響了全世界億萬人的身體健康，這類呼吸道疾病的病理生理過程通常伴有氣道炎癥反應(yīng)，但其發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明。氣道上皮細(xì)胞是呼吸道的第一道生理屏障，其與吸入的各種刺激物(如病原體、污染物和變應(yīng)原)直接接觸，可作為啟動(dòng)和促發(fā)炎癥反應(yīng)的始動(dòng)環(huán)節(jié)[2]。經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道蛋白6(transient receptor potential channel 6，TRPC6)是一種非選擇性鈣離子通道，其基因編碼的蛋白在人體腦、腎和肝等多個(gè)器官中均有表達(dá)，而在肺臟中的表達(dá)尤為豐富[3]。本課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可通過其受體Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)以及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號(hào)通路誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞16HBE內(nèi)TRPC6的過表達(dá)及鈣動(dòng)員，使細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signalregulated kinase，ERK1/2)、p38和核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)發(fā)生磷酸化，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。NF-κB是由P65和P50組成的異源二聚體，其作為一種多功能核轉(zhuǎn)錄因子，能促進(jìn)細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子等的轉(zhuǎn)錄和翻譯，在機(jī)體細(xì)胞的生長發(fā)育、免疫應(yīng)答以及炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[5]。當(dāng)抑制因子IκB與NF-κB二聚體相結(jié)合時(shí)，NF-κB以失活狀態(tài)存在于胞漿中；當(dāng)受到外源刺激時(shí)，IκB經(jīng)泛素化和蛋白酶途徑降解后與NF-κB二聚體發(fā)生解體，從而使NF-κB發(fā)生活化和核轉(zhuǎn)位發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用。本文探討TLR4/TRPC6在LPS誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞內(nèi)NF-κB P65表達(dá)和核轉(zhuǎn)位的作用，以期了解氣道上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)LPS除了使NF-κB磷酸化，能否通過TLR4/TRPC6調(diào)控NF-κB的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位，從而為氣道炎癥的發(fā)生機(jī)制補(bǔ)充新的內(nèi)容。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和主要試劑

氣道上皮細(xì)胞株16HBE購自廣州吉尼歐生物科技有限公司。胎牛血清和高糖DMEM培養(yǎng)液購自Gibco；TRIzol購自Invitrogen；RT-PCR試劑盒購自TaKaRa；LPS、CLI-095和Hyp9購自Sigma；抗TRPC6抗體和山羊抗兔 II 抗購自CST；抗NF-κB P65抗體購自Abcam；山羊抗兔免疫熒光II抗購自北京中杉金橋公司；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 16HBE細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于25 mL培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次，待細(xì)胞于對(duì)數(shù)生長期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前將含10%胎牛血清的培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后按參考文獻(xiàn)[4]方法加入CLI-095(5 μmol/L)、Hyp9(10 μmol/L)和LPS(1 mg/L)處理16HBE細(xì)胞。

2.2RT-PCR實(shí)驗(yàn) 收集待測樣本，加1 mL TRIzol后常規(guī)方法分離純化各組細(xì)胞的總RNA，分光光度計(jì)測定總RNA的含量及濃度。按照RT-PCR試劑盒提供的方法，將2 μL RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體積為20 μL，其中2 μL 10×Ex Taq緩沖液(Mg2+Plus)、0.1 μL TaKaRa Ex Taq酶(5×106U/L)、1.6 μL混合dNTP(2.5 mmol/L each)、0.8 μL上游引物(10 μmol/L)、0.8 μL下游引物(10 μmol/L)、2 μL cDNA模板(100 ng)和12.7 μL無RNA酶去離子水。PCR引物序列由英濰捷基(上海公司)合成，序列見表1。反應(yīng)參數(shù)為: 95 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性15 s、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s(NF-κB P65進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，β-actin進(jìn)行25個(gè)循環(huán))；循環(huán)結(jié)束后72 ℃再延伸5 min。取PCR產(chǎn)物10 μL與上樣緩沖液2 μL混合，行2%瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像系統(tǒng)拍照后用ImageJ軟件分析各目的基因條帶灰度與β-actin條帶灰度的比值。

表1 RT-PCR引物序列

2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞吸出培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS緩沖液沖洗3遍，加入4%細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，取適量總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，將總蛋白用濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入I 抗4 ℃封閉過夜，TBST緩沖液洗膜，加入II 抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜，ECL發(fā)光顯影，以目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH的吸光度之比作為其相對(duì)表達(dá)量。

3.4免疫細(xì)胞化學(xué)染色法 各組細(xì)胞用PBS沖洗3遍后，迅速用冰甲醇固定10 min，0.3% Triton X-100 室溫通透10 min，加入山羊血清室溫封閉30 min，然后用抗NF-κB P65抗體4 ℃封閉過夜；次日復(fù)溫30 min后用PBS 洗3遍后，加入II 抗37 ℃避光孵育2 h，DAPI染核，5%甘油封片鏡檢，采用免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡觀測NF-κB P65的熒光表達(dá)及亞細(xì)胞定位。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。全部計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，運(yùn)用最小顯著性差異法(LSD法)進(jìn)行組間兩兩比較，并運(yùn)用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行組間多重比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LPS上調(diào)16HBE細(xì)胞NF-κB P65的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位

16HBE細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)至50%～60%密度融合時(shí)將含10%胎牛血清的培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，加入LPS(1 mg/L)分別刺激細(xì)胞0、0.5、2、6、12和24 h后，使用RT-PCR、Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法分別檢測16HBE 細(xì)胞內(nèi)NF-κB P65的mRNA和蛋白表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位的情況。結(jié)果顯示與正常組相比，LPS作用于16HBE細(xì)胞6 h后，NF-κB P65的mRNA和蛋白表達(dá)開始顯著上調(diào)，持續(xù)到24 h(P<0.05)，見圖1A、1B；在LPS作用2 h時(shí)NF-κB P65開始出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位，隨著時(shí)間的延長，核轉(zhuǎn)位越來越明顯，見圖1C。

Figure 1.The effects of LPS stimulation on NF-κB P65 expression and nuclear translocation in the 16HBE cells at different times. A:the mRNA expression of NF-κB P65 was detected by RT-PCR; B: the protein expression of NF-κB P65 was determined by Western blot; C: the nuclear translocation of NF-κB P65 was detected by immunocytochemical staining (×400). Mean±SEM.n=4.*P<0.05vs0 h group.

圖1 LPS刺激不同時(shí)點(diǎn)對(duì)16HBE細(xì)胞NF-κB P65表達(dá)與核轉(zhuǎn)位的影響

2 TLR4介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞內(nèi)NF-κB P65的表達(dá)上調(diào)和核轉(zhuǎn)位

16HBE細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待生長密度至50%～60%時(shí)將含10%胎牛血清的培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,后分成對(duì)照(control)組、LPS組和LPS+CLI-095組,CLI-095(5 μmol/L)預(yù)處理30 min后加入LPS(1 mg/L)處理16HBE細(xì)胞6 h，使用RT-PCR、Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法分別檢測細(xì)胞內(nèi)NF-κB P65 的mRNA和蛋白表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位。結(jié)果顯示TLR4抑制劑CLI-095能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞內(nèi)NF-κB P65的表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The effects of TLR4 inhibitor CLI-095 on LPS-induced NF-κB P65 expression and nuclear translocation in the 16HBE cells. A:the mRNA expression of NF-κB P65 was detected by RT-PCR; B:the protein expression of NF-κB P65 was determined by Western blot; C:the nuclear translocation of NF-κB P65 was detected by immunocytochemical staining(×400). Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖2 TLR4抑制劑CLI-095對(duì)LPS誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞NF-κB P65表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位的影響

3 TRPC6介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞內(nèi)NF-κB P65的表達(dá)上調(diào)和核轉(zhuǎn)位

16HBE細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待生長密度至50%～60% 融合時(shí)，將生長培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，后分成control組、LPS組、Hyp9組和LPS+Hyp9組。單獨(dú)或同時(shí)加入Hyp9(10 μmol/L)和LPS(1 mg/L)刺激16HBE細(xì)胞6 h，應(yīng)用RT-PCR、Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法分別檢測16HBE細(xì)胞內(nèi)NF-κB P65的mRNA和蛋白表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果顯示與正常組相比，Hyp9組和LPS組的NF-κB P65表達(dá)均明顯增加并出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位，且LPS+ Hyp9組比單獨(dú)的Hyp9組和LPS組NF-κB P65的表達(dá)增加(P<0.05),核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象更為明顯，見圖3。

討 論

NF-κB在多種肺部疾病，如急性肺損傷、肺部感染、哮喘、慢性阻塞性肺疾病以及肺纖維化中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Bureau等[6]發(fā)現(xiàn)，與一般炎癥不同的是，即使撤去致敏原，哮喘動(dòng)物氣道細(xì)胞中的NF-κB仍持續(xù)活化，而一些公認(rèn)的NF-κB激活物，如過敏原、臭氧和LPS等可使哮喘癥狀惡化；反之，如果阻斷NF-κB的活化可以減輕LPS誘導(dǎo)的大鼠氣道炎癥[7]。Hart等[8]利用凝膠電泳遷移率變動(dòng)分析和免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)，輕度哮喘患者的支氣管活檢標(biāo)本和痰液中NF-κB的活化程度較正常人高，且NF-κB表達(dá)在氣道上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞上，這些研究提示，NF-κB是氣道炎癥相關(guān)疾病防治的潛在靶點(diǎn)。本課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，1 mg/L LPS作用16HBE細(xì)胞6 h后炎癥因子白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)和IL-8開始顯著增高，持續(xù)到24 h。在本實(shí)驗(yàn)中，同樣采用1 mg/L LPS刺激16HBE細(xì)胞6 h，NF-κB表達(dá)和核轉(zhuǎn)位的變化規(guī)律與前期研究一致。TLR4是天然免疫系統(tǒng)識(shí)別病原微生物抗原的主要受體。本研究采用TLR4的抑制劑CLI-095處理16HBE細(xì)胞后，LPS誘導(dǎo)的NF-κB P65的表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位顯著下降，進(jìn)一步表明TLR4介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞內(nèi)NF-κB P65的表達(dá)上調(diào)和核轉(zhuǎn)位。

Figure 3.The effects of TRPC6 activator Hyp9 on LPS-induced NF-κB P65 expression and nuclear translocation in the 16HBE cells. A:the mRNA expression of NF-κB P65 was detected by RT-PCR; B:the protein expression of NF-κB P65 was determined by Western blot; C:the nuclear translocation of NF-κB P65 was detected by immunocytochemical staining(×400). Mean±SEM.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHyp9 group;&P<0.05vsLPS group.

圖3 TRPC6激動(dòng)劑Hyp9對(duì)LPS誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞NF-κB P65表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位的影響

TRPC6參與調(diào)控動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞周期、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等一系列的生理和病理過程，其基因突變或過表達(dá)可導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子信號(hào)通路異常從而引起多種病理生理改變[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)[10-11]，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到各種炎癥介質(zhì)的刺激時(shí)能被TRPC6調(diào)控從而增加細(xì)胞膜通透性。還有研究發(fā)現(xiàn)，慢性阻塞性肺疾病和哮喘患者中TRPC6的mRNA表達(dá)較正常組上調(diào)[12-13]。另外，Sel等[14]用卵白蛋白急性致敏TRPC6基因敲除小鼠建立氣道炎癥模型，TRPC6敲除可以減弱小鼠的過敏性反應(yīng)，且TRPC6介導(dǎo)的免疫功能主要定位在Th2淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞。有趣的是，Damann等[15]也發(fā)現(xiàn)TRPC6敲除小鼠來源的中性粒細(xì)胞的遷移能力較正常組減弱。以上研究提示，TRPC6在氣道炎癥反應(yīng)中起重要作用，然而其在氣道上皮細(xì)胞中的作用尚不明確。本課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，TRPC6可調(diào)控LPS誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞中炎癥因子IL-6和IL-8的分泌以及NF-κB P65的磷酸化水平。另外，研究還發(fā)現(xiàn)TLR4特異性抑制劑CLI-095可拮抗LPS誘導(dǎo)的TRPC6 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，表明TLR4是TRPC6的上游信號(hào)通路。Hyp9作為一種簡化的二乙酰間苯三酚衍生物可以選擇性激活TRPC6通道，引起鈣離子內(nèi)流[4, 16]。本研究進(jìn)一步使用TRPC6的激動(dòng)劑Hyp9處理16HBE細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的NF-κB P65表達(dá)和核轉(zhuǎn)位明顯增加。以上研究表明，TLR4-TRPC6信號(hào)通路除了使NF-κB磷酸化，還能調(diào)控NF-κB P65表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。

綜上所述，LPS通過TLR4-TRPC6信號(hào)通路調(diào)控氣道上皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB P65的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位，不僅為TRPC6調(diào)控氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制補(bǔ)充新的內(nèi)容，也為氣道炎癥性呼吸道疾病的防治提供靶點(diǎn)。