王霖 王曉燕 李才信

【摘要】 目的 探討利福平耐藥結核桿菌實時熒光定量擴增檢測技術（GeneXpert）、結核感染T細胞檢測（QFT.TB）和結核桿菌快速培養(yǎng)、鑒定及藥敏培養(yǎng)（BACTEC MGIT 960）快速聯合檢測在肺結核診斷中的應用研究。方法 選取200例疑似肺結核患者作為研究對象， 均行GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960快速聯合檢測。比較GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960單純檢測與聯合檢測結核病的結果;GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960單純檢測與聯合檢測肺結核病效能。結果 QFT.TB、 QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960對肺結核檢測的陽性率分別為73.5%、81.5%、81.5%， 高于GeneXpert、BACTEC MGIT 960單獨檢測及二者聯合檢測的44.0%、39.0%、44.0%， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。QFT.TB、QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960診斷肺結核的AUC比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）， 但QFT.TB、QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960診斷肺結核的AUC均大于GeneXpert、BACTEC MGIT 960、GeneXpert+BACTEC MGIT 960的AUC， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 肺結核診斷中， GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960三者快速聯合檢測的結果準確、可靠， 價值更高， 值得在臨床上推廣與應用。

【關鍵詞】 利福平耐藥結核桿菌實時熒光定量擴增檢測技術;結核感染T細胞檢測;鑒定及藥敏培養(yǎng);快速聯合檢測;肺結核

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.22.008

【Abstract】 Objective ? To study the application of real-time fluorescence quantitative for detection of rifampicin-resistant （GeneXpert）， T cells detection for tuberculosis infection （QFT.TB） and rapid culture， identification and drug sensitivity culture （BACTEC MGIT 960） rapid combined detection in the diagnosis of tuberculosis. Methods ? A total of 200 suspected pulmonary tuberculosis patients were selected as the study subjects， and all of them were detected by GeneXpert， QFT.TB and BACTEC MGIT 960. The results and efficacy of simple detection and joint detection of GeneXpert， QFT.TB and BACTEC MGIT 960 for tuberculosis were compared. Results ? The positive rates of QFT.TB， QFT.TB+BACTEC MGIT 960， GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960 for tuberculosis detection were 73.5%， 81.5%， and 81.5%， respectively， which were higher than 44.0%， 39.0% and 44.0% by simple and combined detection of GeneXpert and BACTEC MGIT 960， and their difference was statistically significant （P<0.05）. There was no statistically significant difference in AUC between QFT.TB， QFT.TB+BACTEC MGIT 960， GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960 for diagnosis of tuberculosis （P>0.05）. However， the AUC of the diagnosed tuberculosis of QFT.TB， QFT.TB+BACTEC MGIT 960， GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960 was greater than the AUC of GeneXpert， BACTEC MGIT 960， GeneXpert+BACTEC MGIT 960， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion ? In the diagnosis of tuberculosis， the results of the rapid combined detection of GeneXpert， QFT.TB and BACTEC MGIT 960 are accurate， reliable and of higher value. This method is worthy of clinical promotion and application.

【Key words】 Real-time fluorescence quantitative for detection of rifampicin-resistant; T cells detection for tuberculosis infection; Identification and drug susceptibility culture; Rapid combined detection; Pulmonary tuberculosis

近年來， 肺結核的發(fā)病人數越來越多， 各種診斷方法也不斷涌現， 新出現的免疫學技術、分子生物學技術為臨床上快速診斷肺結核以及結核分枝桿菌（MTB）耐藥性奠定了基礎[1]。GeneXpert是臨床上新型的診斷MTB與耐藥性的分子診斷技術（美國Cepheid公司研發(fā)）， 該檢測方法在臨床上引起了高度的重視[2]。WHO推薦 Xpert應當用于多重抗藥性結核?。∕DR-TB）和人類免疫缺陷病毒（HIV）高發(fā)病率地區(qū)的快速篩查， Xpert可用于兒童結核病的早期診斷， 推薦Xpert替代涂片、培養(yǎng)等技術用于肺外結核的快速診斷。QFT.TB是臨床上應用MTB特異性抗原來刺激外周血單個核細胞分泌γ-干擾素（IFN-γ）含量的一種檢測技術， 它主要是為了判斷MTB是否發(fā)生了感染[3]。BACTEC MGIT 960主要應用了熒光法原理， 通過感應培養(yǎng)管內氧濃度的消耗情況來對MTB的生長狀況進行反映的技術， 它可以實施24 h動態(tài)監(jiān)測[4]。本院在肺結核診斷中， 應用GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960快速聯合檢測， 檢測陽性率比單純使用一種方法檢測或者是兩種檢測方法聯合的診斷結果準確可靠， 現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2017年10月～2019年3月本院收治的疑似肺結核患者200例作為研究對象。納入標準：患者均知曉同意此次研究。排除標準：①不符合肺結核診斷標準的患者;②不同意本次研究的患者;③存在其他重大疾病的患者;④精神異常的患者。200例患者中， 男145例， 女55例;年齡18～80歲， 平均年齡（56.5±12.9）歲。本次研究通過了本院倫理委員會審批。

1. 2 方法

1. 2. 1 標本收集

1. 2. 1. 1 痰標本收集 患者在收集標本前用清水漱口2次后， 將無菌痰瓶打開深吸氣用力從肺部將痰液咳出， 將痰液收集到痰瓶中， 將瓶蓋擰緊后保存在2～8℃環(huán)境下及時送到檢驗科。

1. 2. 1. 2 穿刺液、支氣管灌洗液標本 嚴格按照臨床無菌操作規(guī)程來對標本進行收集[5]。

1. 2. 2 GeneXpert檢測

1. 2. 2. 1 收集1 ml痰液樣本至50 ml刻度離心管中， 加入痰液樣本2倍體積的樣本處理液， 將混合好的樣本在20～30℃放下置10 min， 渦旋震蕩至少10 s， 放置5 min。

1. 2. 2. 2 穿刺液、支刷物、支氣管灌洗液等標本3000 r/min，?離心15 min去上清留沉淀， 加入2 ml樣本處理液同痰標本處理方式進行。試劑盒經儀器識別檢測后， 將處理后的樣品2 ml由檢測匣的加樣孔緩慢加入。

1. 2. 2. 3 將其放置到檢測模塊儀器中自動進行檢測， 2 h后系統(tǒng)會對利福平耐藥檢測結果、MTB檢測結果進行自動判讀[6]。利福平檢測結果主要為敏感、耐藥;MTB檢測結核菌結果為陽性或陰性。

1. 2. 3 QFT.TB檢測

1. 2. 3. 1 標本收集：用肝素鋰抗凝采血管采集5 ml靜脈血， 樣本采集后4 h內送檢。

1. 2. 3. 2 把處理后的樣本培養(yǎng)管放入培養(yǎng)箱內孵育16～24 h。

1. 2. 3. 3 第2天孵育結束后， 從培養(yǎng)箱內拿出培養(yǎng)管，?3000 r/min， 離心15 min， 離心好以后備用。

1. 2. 3. 4 進行試劑的配置、標準品的配置、酶結合物的配置、洗滌液配置。

1. 2. 3. 5 按操作步驟進行處理后， 洗板、顯色， 加終止液， 比色。

1. 2. 3. 6 結果報告：結果判定：①陰性：陽性管>0.5 IU/ml，?抗原管-陰性管<0.35 IU/ml;②陽性：抗原管-陰性管≥0.35 IU/ml;③不定：陽性管<0.35 IU/ml， 抗原管-陰性管<0.35 IU/ml或陰性管≥8.0 IU/ml[7]。

1. 2. 4 BACTEC MGIT 960檢測

1. 2. 4. 1 痰標本直接留取1～2 ml， 其他標本取5～10 ml于刻度離心管以4600 r/min離心15 min后留沉淀物于刻度離心管內， 并在管壁上標注編號和日期。

1. 2. 4. 2 加入4% NaOH 5～7 ml并用竹簽打磨至痰液完全液化（液化過程控制在15～20 min）， 平衡離心管后4600 r/min， 離心10 min。

1. 2. 4. 3 取出離心管后棄上清液， 加滅菌PBS緩沖液2～3 ml，?混勻后4600 r/min， 離心10 min。取出離心管后棄上清液， 加滅菌PBS 2 ml， 充分混勻。

1. 2. 4. 4 于培養(yǎng)管中加入0.8 ml營養(yǎng)添加劑/雜菌抑制劑混合物， 用加樣器取0.5 ml處理后的標本液加入MGIT培養(yǎng)管內， 儀器自動培養(yǎng)報告結果。

1. 2. 4. 5 結果報告：MTB BACTEC MGIT 960檢測陰性或陽性， 將標本取出經過抗酸染色后為陽性的為MTB陽性， 將陽性標本再經過噻吩-2-羧酸肼、耐熱觸酶試驗、8℃生長試驗、硝基苯甲酸生長試驗判斷為MTB陽性或者是陰性[8]。藥敏結果判斷：當生長對照管為陽性時儀器開始對藥敏管結果進行判讀， 對連續(xù)2 d的結果進行判讀。當藥敏管在生長對照管出現陽性后2 d仍然無生長則判斷為敏感， 有細菌生長則判斷為耐藥。

1. 3 觀察指標 ①比較GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960單純檢測與聯合檢測結果。②比較GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960單純檢測與聯合檢測肺結核病效能。

1. 4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件對數據進行處理。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗， 多組比較采用方差分析;計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。用Graphpad Prism5 軟件繪制受試者工作特征（ROC）曲線， 評價單個檢測方法的效能， 曲線下面積（AUC）比較采用Z檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2. 1 GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960單純檢測與聯合檢測結果對比 QFT.TB、 QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960對肺結核檢測的陽性率分別為73.5%、81.5%、81.5%， 高于GeneXpert、BACTEC MGIT 960單獨檢測及二者聯合檢測的44.0%、39.0%、44.0%， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960單純檢測與聯合檢測肺結核病效能對比 QFT.TB、 QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960診斷肺結核的AUC比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）， 但QFT.TB、 QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960診斷肺結核的AUC均大于GeneXpert、BACTEC MGIT 960、GeneXpert+BACTEC MGIT 960的AUC， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

結核病是由MTB引起的慢性傳染病。中國結核病防治形勢非常嚴峻， 2014 年估算的發(fā)病例數為93萬， 位居全球第三位， 是全球22個高負擔國家之一[9]。

GeneXpert是臨床上新型的診斷MTB與耐藥性的分子診斷技術， 主要是以半巢式實時熒光PCR技術為基礎對分子進行檢測， 通過該檢測方法在2 h內就可以檢出利福平的耐藥性、MTB， 由于利福平一般沒有單藥耐藥情況， 臨床上常將利福平耐藥作為診斷耐多藥結核病的標準[10]。WHO關于Xpert推薦意見-2013（修訂版）， Xpert應當用于MDR和HIV高發(fā)病率地區(qū)的快速篩查， Xpert可用于兒童結核病的早期診斷， 推薦Xpert替代涂片、培養(yǎng)等技術用于肺外結核的快速診斷。

QFT.TB主要是檢測血液中特異的T淋巴細胞、IFN-γ的技術， 它的敏感度非常高， 不容易受到CD4+ T淋巴細胞數量的影響。應用該方法對結核病合并免疫缺陷患者進行檢測的效果仍然較為準確。2016美國CDC指南推薦全血γ-干擾素釋放試驗（IGRA）的測定方法， 是其他國家人員進入美國境內的結核感染的篩查方法之一。

BACTEC MGIT 960是當前臨床上進行藥敏試驗、MTB培養(yǎng)的主要方法， 但是對于肺結核、肺外結核患者來說常需要將以上3種方法聯合進行檢測， 肺結核患者檢測結果陽性率高于非肺結核患者[11]。肺外結核患者、肺結核患者經過QFT.TB檢測的陽性率高于GeneXpert、BACTEC MGIT 960檢測方法。

GeneXpert可以對MTB的核酸、利福平的耐藥性進行直接的檢測， 它在診斷耐藥結核病的期間發(fā)揮了關鍵性作用， 且該方法的操作步驟較為簡單， 可以有效減少基因檢測污染狀況的發(fā)生。QFT.TB主要是檢測MTB T細胞介導的IFN-γ反應（由CFP-10、ESAT-6、P4所引發(fā)）， 對于早期菌陰結核病患者與結核病患者來說， 應用該方法檢測的價值較高。BACTEC MGIT 960可以對MTB進行快速培養(yǎng)的結果進行準確、快速的檢測， 而單純使用一種方法的效能并不能達到理想的狀態(tài)， 而將其與GeneXpert、QFT.TB聯合進行快速檢測， 可以顯著提高臨床診斷效能。

常規(guī)對結核病輔助診斷的方法有痰涂片找抗酸桿菌、痰培養(yǎng)法、血清學方法等， 但這些方法的特異性和敏感性均較低。3種方法聯合檢測， 互相彌補不足， 從而減少肺結核病的誤診， 漏診， 是一組值得推廣的檢測方法。特別是有更高的陰性預測值， 有利于排除肺結核病的診斷[12]。

本研究顯示， QFT.TB、 QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960對肺結核檢測的陽性率分別為73.5%、81.5%、81.5%， 高于GeneXpert、BACTEC MGIT 960單獨檢測及二者聯合檢測的44.0%、39.0%、44.0%， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。QFT.TB、 QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960診斷肺結核的AUC比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）， 但QFT.TB、 QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960診斷肺結核的AUC均大于GeneXpert、BACTEC MGIT 960、GeneXpert+BACTEC MGIT 960的AUC， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

綜上所述， 在肺結核診斷中， 應用GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960快速聯合檢測， 檢測陽性率及效能最高， 臨床利用價值很大， 為診斷肺結核患者提供了新的方法與途徑， 值得在臨床上多加廣泛推廣與應用。