杜瑞雪，王麗麗，張暢，李善姬，*

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林132013；2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉133002）

我國著名藥典《本草綱目》詳細(xì)描述了大蒜健脾、解毒、消炎等作用，大蒜含有豐富的營養(yǎng)成分，包括氨基酸，糖類，維生素，微量元素等。大蒜中有17 種氨基酸[1]，微量元素硒含量豐富[2]，有效成分主要為含硫化合物，蒜氨酸和蒜酶以及大蒜破壞后產(chǎn)生的大蒜素[3]，黑蒜又稱黑大蒜，是由帶皮的新鮮大蒜在一定的環(huán)境下，不使用任何添加劑或其他化學(xué)制劑，自然發(fā)酵而成，其黑變過程發(fā)生的是Maillard 反應(yīng)[4]，發(fā)酵后的黑蒜味道酸甜，無刺激性氣味，黑蒜與大蒜相比，抗氧化、抗酸化功效不僅提高了數(shù)十倍，又把大蒜本身的蛋白質(zhì)大量轉(zhuǎn)化成為人體每天所必需的多種氨基酸，生物有效成分及生理功能明顯提高[5]，主要有抗氧化作用[6]、防癌抗癌作用[7]、胃腸道保護(hù)作用[8]、調(diào)節(jié)血糖水平[9]以及改善記憶力的功能[10]。

多糖是參與機(jī)體供能的營養(yǎng)物質(zhì)，也參與維持機(jī)體的多種生理功能，大蒜多糖是大蒜的主要成分，藥理研究顯示大蒜多糖具有抗凝血、降血脂和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等生理功能[11]，資料報(bào)道大蒜多糖還具有抗糖尿、保護(hù)肝功能、抗腫瘤和預(yù)防衰老等作用[12-13]。經(jīng)發(fā)酵的黑蒜營養(yǎng)成分發(fā)生了變化，但黑蒜多糖的研究匱乏，越來越多的醫(yī)學(xué)研究證明，許多慢性疾病包括心血管、內(nèi)分泌、胃腸道等方面的疾病以及白內(nèi)障、衰老和各類癌癥等，都與氧自由基的產(chǎn)生有關(guān)[14]，機(jī)體代謝會(huì)產(chǎn)生少量自由基，人體內(nèi)有抑制自由基反應(yīng)的體系，如果遭到破壞，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷[15]。祝炳俏等[4]最早運(yùn)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)說明黑蒜的抗氧化作用明顯好于大蒜，Sun YE 等[16]優(yōu)化了黑蒜的發(fā)酵條件，保持75 ℃溫度和相對濕度85%發(fā)酵8 d，發(fā)酵的黑蒜保留了理想的抗氧化能力和豐富的營養(yǎng)，測定其自由基清除能力變化，結(jié)果顯示黑蒜清除自由基的能力顯著強(qiáng)于大蒜，這對研究高效、無毒副作用的天然抗氧化物質(zhì)有重要意義。本研究從測定黑蒜多糖含量及抗氧化活性出發(fā)來研究黑蒜的營養(yǎng)價(jià)值，為開發(fā)功能食品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大蒜：云南大理；苯酚、無水乙醚、正丁醇、無水乙醇、氯仿、硫酸、鹽酸、硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲、鄰苯三酚：均為分析純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；無水葡萄糖、水楊酸、抗壞血酸、過氧化氫：均為分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；活性炭（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

發(fā)酵鍋（DHC-7000C）：韓國Dorim；電熱恒溫干燥箱（202-1A 型）：天津市泰斯特儀器有限公司；分析天平（FA1104N）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；原子吸收分光光度計(jì)（6810 型）：上海森譜科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A 型）：上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-111A 型）：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；漩渦混合器（MVS-1 型）：北京金北德工貿(mào)有限公司；中藥粉碎機(jī)（AF-20A 型）：溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料處理

將大蒜去皮、洗凈放入發(fā)酵鍋內(nèi)30 h 即可制得黑蒜，將大蒜和黑蒜干燥至恒重，粉碎，過40 目篩，貯存?zhèn)溆?。再將干燥的黑蒜、大蒜粉末，分別用濾紙包成包，放到索氏提取器中，使用乙醚進(jìn)行脫脂，回流至濾液呈無色透明，干燥備用。

1.2.2 多糖的提取

料液比 1∶30（g/mL）配液→熱水浸提（時(shí)間 2.25 h，提取溫度75.3 ℃[17]）→4 層紗布過濾得濾液→活性炭脫色→離心取上清→上清液濃縮→去蛋白（Sevag 方法振蕩去除）→醇沉24 h→烘干備用。

1.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法，精確移取葡萄糖1 mg/mL 對照儲備液 0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mL，定容至100 mL，制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取2.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)液加入6 %苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，于40 ℃水浴中顯色 40 min，冷卻至 22 ℃～25 ℃后，用分光光度儀在490 nm 波長處測定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。

1.2.4 多糖含量測定

制作大蒜、黑蒜多糖供試液，用苯酚-硫酸法測定吸光度，平行測定3 次，根據(jù)回歸方程計(jì)算多糖含量。根據(jù)公式（1）計(jì)算多糖含量。

式中：c 為多糖溶液中葡萄糖的濃度，mg/mL；v 為樣品提取時(shí)的定容體積，mL；n 為稀釋倍數(shù)；m 為大蒜/黑蒜的質(zhì)量，g。

1.2.5 DPPH 自由基清除率的測定

采用改進(jìn)的Nagai 法[17]，取各濃度多糖樣品液，加入DPPH 60%乙醇溶液4 mL，混勻，放置30 min。于波長517 nm 處測定吸光度值，平行測定3 次。根據(jù)公式（2）計(jì)算自由基清除率：

式中：Ai為樣品與自由基反應(yīng)后的吸光度；Ac表示空白對照的吸光度。

1.2.6 羥自由基清除率的測定

取樣品液于具塞比色管中，按順序依次加入6 mmol/L FeSO4，6 mmol/L 水楊酸 1 mL，充分搖勻后加入6 mmol/L H2O21 mL 啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃水浴1 h，于波長510 nm 處測定各管的吸光度值，平行測定3 次，根據(jù)公式（3）計(jì)算抑制率：

式中：Ai表示樣品與自由基反應(yīng)后的吸光度；Ac表示空白對照的吸光度。

1.2.7 超氧陰離子自由基清除率的測定

采用鄰苯三酚自氧化法，不同濃度樣品液加入2.4 mL Tris-HCl 緩沖液（pH 8.2），混勻，預(yù)熱后加入0.1 mL 7 mmol/L 的鄰苯三酚開始反應(yīng)，后加入1 滴10 mol/L 的濃鹽酸終止反應(yīng)，隨后在325 nm 處測定體系的吸光度值，平行測定3 次，根據(jù)公式（4）計(jì)算抑制率：

式中：Ai表示樣品與自由基反應(yīng)后的吸光度；Ac表示空白對照的吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)處理采用Excel 數(shù)據(jù)庫錄入數(shù)據(jù)并用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以表示，以P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量測定

繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y=10.743x-0.006，R2=0.999 1，測得大蒜和黑蒜吸光度數(shù)值，結(jié)果見表1。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程計(jì)算出大蒜多糖的含量為50.33 mg/g，黑蒜多糖的含量為98.67 mg/g。大蒜在發(fā)酵成黑蒜過程中，發(fā)生美拉德反應(yīng)，顏色變黑，黏度和糖分增加，口感變得軟綿酸甜，經(jīng)測定多糖含量，可以確定，增加的有效物質(zhì)為多糖。本試驗(yàn)用的是水提醇沉法提取多糖，此種方法比水提取法提取的多糖含量高，試驗(yàn)材料簡單易得，控制了溫度和醇沉?xí)r間，得到最佳提取方法。

表1 黑蒜和大蒜的多糖樣品液吸光度值Table 1 The absorbance value of black garlic and garlic polysaccharide

2.2 DPPH 自由基清除率測定結(jié)果

DPPH 自由基有機(jī)溶液常溫下呈紫色，在波長517 nm 處有最大吸光度，通過分光光度法測定吸光度的降低來監(jiān)測樣品自由基清除能力。黑蒜和大蒜多糖對DPPH 自由基的清除率見表2、圖1。

由表2、圖1 結(jié)果可知，各樣品的DPPH 自由基清除率與用量均顯示正相關(guān)，VC組顯示了較強(qiáng)的清除率，并保持在96%左右。大蒜組的清除率在低濃度200 μg/mL 時(shí)，為 9.31%，用量增加到 1000 μg/mL 后，清除率達(dá)到28.47%，低于對應(yīng)的VC組。黑蒜組的清除率在低濃度200 μg/mL 時(shí)為42.24 %，用量增加到1 000 μg/mL 后，清除率達(dá)到79.21%，同樣低于對應(yīng)的VC組。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示對應(yīng)濃度下，黑蒜、大蒜和VC組比較，均有P＜0.01，抗氧化能力VC＞黑蒜＞大蒜。

表2 黑蒜和大蒜多糖對DPPH 自由基的清除作用（，n=3）Table 2 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on DPPH（，n=3）

表2 黑蒜和大蒜多糖對DPPH 自由基的清除作用（，n=3）Table 2 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on DPPH（，n=3）

注：* 表示與 VC 組比較，P＜0.01，# 表示與大蒜組比較，P＜0.01。

各樣品不同濃度下樣品的清除率/%200 μg/mL 400 μg/mL 600 μg/mL 800 μg/mL 1000 μg/mL VC 95.01±0.006 2 95.59±0.007 0 96.22±0.006 1 96.49±0.006 2 97.30±0.008 4大蒜 9.31±0.007 0* 10.79±0.008 4* 20.11±0.006 1* 24.70±0.010 7* 28.47±0.010 2*黑蒜 42.24±0.008 4*# 53.17±0.008 4*# 65.99±0.007 0*# 73.68±0.010 7*# 79.21±0.010 1*#

圖1 黑蒜和大蒜多糖對DPPH 自由基的清除率Fig.1 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on DPPH

2.3 羥自由基清除率結(jié)果

羥自由基具有極強(qiáng)的氧化能力，在體內(nèi)主要由過氧化物負(fù)離子和過氧化氫反應(yīng)生成，加入水楊酸反應(yīng)，生成有特殊吸收的2，3-二羥基苯甲酸，如果向反應(yīng)體系中加入具有清除羥自由基功能的樣品，就會(huì)減少生成的羥自由基，固定反應(yīng)時(shí)間，在510 nm 處測樣品的吸光度，結(jié)果見表3、圖2。

由表3、圖2 結(jié)果可知，各樣品的·OH 清除率與用量均顯示正相關(guān)，VC組顯示了較強(qiáng)的清除率，最高濃度時(shí)為90.15%。大蒜組的清除率在最低濃度200 μg/mL時(shí)為4.08%，最高濃度1 000 μg/mL 時(shí)為20.02%。黑蒜組的清除率在最低濃度200 μg/mL 時(shí)為5.70%，最高濃度1 000 μg/mL 時(shí)為27.55%。對應(yīng)濃度下，黑蒜、大蒜和VC組比較，均有P＜0.01，抗氧化能力VC＞黑蒜＞大蒜。

表3 黑蒜和大蒜多糖對羥自由基的清除作用（，n=3）Table 3 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on hydroxyl radical（，n=3）

表3 黑蒜和大蒜多糖對羥自由基的清除作用（，n=3）Table 3 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on hydroxyl radical（，n=3）

注：* 表示與 VC 組比較，P＜0.01，# 表示與大蒜組比較，P＜0.01。

各樣品不同濃度下樣品的清除率/%200 μg/mL 400 μg/mL 600 μg/mL 800 μg/mL 1000 μg/mL VC 30.91±0.002 6 41.99±0.001 8 63.42±0.002 0 87.02±0.003 5 90.15±0.003 2大蒜 4.08±0.002 4* 4.85±0.002 0* 9.17±0.002 1* 18.49±0.002 1* 20.02±0.002 5*黑蒜 5.70±0.002 1*# 7.22±0.002 1*# 13.31±0.003 4*# 23.97±0.003 8*# 27.55±0.003 9*#

圖2 黑蒜和大蒜多糖對羥自由基的清除率Fig.2 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on hydroxyl radical

2.4 超氧陰離子自由基清除率結(jié)果

超氧陰離子自由基作為人體內(nèi)存在的自由基，與羥基（-OH）結(jié)合后的產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA 損壞，與人體某些疾病密切相關(guān)。鄰苯三酚自氧化可產(chǎn)生O2-·，在pH＜9.0 時(shí)，鄰苯三酚自氧化速率與生成的O2-·的濃度呈正相關(guān)，通過分光光度計(jì)測定吸光度來測定對自由基的清除能力，間接評價(jià)抗氧化能力。多糖對超氧陰離子自由基的清除率見表4、圖3。

表4 黑蒜和大蒜多糖對超氧陰離子自由基的清除作用（，n=3）Table 4 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on superoxide anion（，n=3）

表4 黑蒜和大蒜多糖對超氧陰離子自由基的清除作用（，n=3）Table 4 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on superoxide anion（，n=3）

注：* 表示與 VC 組比較，P＜0.01，# 表示與大蒜組比較，P＜0.01。

各樣品不同濃度下樣品的清除率/%200 μg/mL 400 μg/mL 600 μg/mL 800 μg/mL 1 000 μg/mL VC 55.85±0.008 6 75.16±0.008 6 81.50±0.011 7 93.30±0.007 1 96.78±0.107大蒜 6.79±0.015 7* 8.04±0.007 1* 13.49±0.005 6* 19.66±0.108* 22.24±0.008 2*黑蒜 34.13±0.005 5*# 39.40±0.007 11*# 51.65±0.179*# 74.62±0.017 8*# 78.02±0.010 7*#

由表4、圖3 結(jié)果可知，各樣品的O2-·自由基清除率與用量均顯示正相關(guān)，VC組顯示了較強(qiáng)的清除率，最高濃度時(shí)為96.78 %。大蒜組的清除率在低濃度200 μg/mL 時(shí)，為 6.79%，用量增加到 1 000 μg/mL 后，清除率達(dá)到22.24%，低于對應(yīng)的VC組。黑蒜組的清除率在低濃度200 μg/mL 時(shí)為34.13%，用量增加到1 000 μg/mL 后，清除率達(dá)到78.02%，也低于對應(yīng)的VC組。對應(yīng)濃度下，黑蒜、大蒜和VC組比較，均有P＜0.01，抗氧化能力VC＞黑蒜＞大蒜。

3 結(jié)論與討論

隨著時(shí)代發(fā)展及生活水平的提高，人們更加注重健康生活，純天然、無毒副作用的天然化合物的開發(fā)和利用成為學(xué)者們研究的熱門話題，多糖存在很多天然植物中，是參與生命活動(dòng)的基本物質(zhì)之一，與維持多種生理功能密切相關(guān)。黑蒜是由新鮮大蒜在適當(dāng)條件下發(fā)酵而成，比普通大蒜具有更高的抗氧化能力，可以增強(qiáng)人體免疫力、對抗疲勞[18]。目前對黑蒜多糖相關(guān)研究還不多，本研究采用傳統(tǒng)水提醇沉法提取大蒜及黑蒜中的多糖，對大蒜和黑蒜的多糖含量和抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，黑蒜、大蒜對DPPH 自由基、羥自由基、超陽陰離子自由基均顯示抗氧化能力，并均具有量效關(guān)系。黑蒜多糖比大蒜多糖具有更強(qiáng)的抗氧化作用，但其抗氧化性低于維生素C。黑蒜作為大蒜的一種新型炮制品具有更多的藥用和食用價(jià)值，應(yīng)進(jìn)一步研究和制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行安全性評價(jià)，為新食品原料申請?zhí)峁┛茖W(xué)依據(jù)。