包曉瑋,韓海霞,杜光明,魏辰業(yè),朱 璇,任 薇,曾蘭君,張亞濤
(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)
紅甜菜(Beta vulgarisvar. rubra)屬黎科(Chenopodiaceae)甜菜屬(Beta),是栽培甜菜的一個(gè)變種,又稱紫菜頭,俗稱牛皮菜,可生食、熟食或制成菜肴[1]。紅甜菜是歐洲和美洲國家的重要蔬菜之一,可以提取甜菜紅素,在馬來西亞、中國、日本、以色列和越南廣泛種植[2]。Ashwini等提出食品中的甜菜紅素既具有審美價(jià)值,又對(duì)健康有積極的影響[3]。甜菜紅素是一種甜菜苷紅色素,廣泛存在于莧科、藜科、紫茉莉科、商陸科等多種植物中,甜菜紅素屬于酮、醌類衍生物色素,是水溶性的天然食用紅色素,食用后不被代謝,無毒副作用,美國食品與藥物管理局對(duì)甜菜紅素作為食用色素的添加用量不作上限規(guī)定。Vidal[4]和Sawicki[5]等證實(shí)甜菜紅素具有抗炎、抗氧化能力和抗腫瘤活性。有研究報(bào)道,甜菜紅素可通過作用在線粒體途徑緩解百草枯對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠造成的肝損傷和肺損傷間質(zhì)性肺炎[6-7]。Farabegoli等通過研究發(fā)現(xiàn)甜菜紅素對(duì)Caco-2腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用,提出可以利用甜菜紅素作為膳食成分,以減少和限制癌癥的發(fā)生和發(fā)展[8]。郝秀梅等[9]研究了紅甜菜水提物及其色素的體外抗氧化能力,結(jié)果表明,紅甜菜水提物及其色素有較強(qiáng)的抗氧化能力,且純化后的紅甜菜色素體外抗氧化能力更突出。王曉宇等[10]研究表明,甜菜紅苷能夠引起人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的凋亡,可能具有抗結(jié)腸癌和其他惡性腫瘤的效果。本研究利用DEAE-52纖維素提取、分離甜菜紅素,同時(shí)利用納濾和噴霧干燥技術(shù)制備甜菜紅素,進(jìn)行甜菜紅素體內(nèi)抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用研究,以期為今后開發(fā)紅甜菜作為功能保健食品提供理論依據(jù)。
紅甜菜來源于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)三坪農(nóng)場農(nóng)學(xué)院。
清潔級(jí)KM小鼠(雄性)、豚鼠均購于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(新)2016003);K592細(xì)胞 中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心;綿羊紅細(xì)胞、印度墨汁 廣東洛孚生物科技有限公司。
谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;噻唑藍(lán)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl-2H-tetrazoliubromide,MTT)、刀豆素A(concanamycin A,ConA) 美國Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜-高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-high resolution mass/mass spectrometry,UPLC-HRMS/MS)系統(tǒng) 美國Thermo Fisher公司;TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;LZ-0.5榨汁破碎一體機(jī) 靖江食品機(jī)械有限公司;納濾機(jī) 廈門世達(dá)膜科技有限公司;OPD-8噴霧干燥儀 上海大川原儀器有限公司;酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司;Shellab型醫(yī)用二氧化碳培養(yǎng)箱 美國希爾頓公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;AE-31數(shù)碼倒置顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)中國有限公司。
1.3.1 甜菜紅素的制備
紅甜菜粉碎→紗布過濾→取汁→DEAE-52纖維素吸附紅甜菜汁→填裝進(jìn)分離柱→體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸溶液洗滌→分離甜菜紅素→收集甜菜紅素
利用納濾膜進(jìn)行過濾濃縮,濃縮后的甜菜紅素的色價(jià)為1 150.5 mL-1。將濃縮汁利用噴霧干燥技術(shù)制備成干粉備用,干物質(zhì)得率為83%。
1.3.2 甜菜紅素UPLC-HRMS/MS分析
樣品處理:將濃縮的甜菜紅素液體經(jīng)0.22 μm膜過濾后用于分析測定。UPLC條件:色譜柱為Poroshell 120 SB-C18柱(50 mm×2.1 mm,2.7 μm),柱溫為30 ℃;流動(dòng)相:A相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液(加0.005 mol/L醋酸銨);B相為甲醇;流速為0.5 mL/min。洗脫梯度為:0~5.0 min,0% B;5.0~12.0 min,0%~10% B;12.0~25.0 min,10%~90% B;25.0~35.0 min,90% B;35.0~36.0 min,90%~0% B;36.0~40.0 min,0% B。MS條件:全掃描模式;正離子模式;分辨率:70 000;誘導(dǎo)解離能量:0 eV;掃描范圍:m/z250~800;檢測離子:m/z551。
1.3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥
小鼠的給藥劑量由實(shí)驗(yàn)室前期藥效學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出的灌胃劑量確定。選用200 只健康的小鼠,體質(zhì)量18~22 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后,隨機(jī)挑選40 只,每組10 只,用于抗氧化實(shí)驗(yàn);其余160 只用于免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)。設(shè)置空白組(灌胃0.25 mL/10 g生理鹽水);將噴霧干燥后的甜菜紅素干粉用生理鹽水溶解,配制甜菜紅素高(100 mg/kg)、中(50 mg/kg)、低(25 mg/kg)劑量組(以干物質(zhì)計(jì))用于灌胃小鼠。每天早晨9∶00灌胃,連續(xù)灌胃15 d。
1.3.4 抗氧化實(shí)驗(yàn)
于末次灌胃2 h后進(jìn)行眼眶采血,然后分離血清。各組小鼠血清中的GSH-Px、SOD活力及MDA濃度按試劑盒說明書方法測定。
1.3.5 免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)
1.3.5.1 脾臟、胸腺指數(shù)及碳廓清能力的測定
末次灌胃2 h后,將稀釋4 倍體積的印度墨汁(10 mL/kg)從小鼠尾部靜脈注入,立即計(jì)時(shí),分別在注入墨汁2 min和10 min時(shí)從小鼠內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL,并立即將其加入到2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% Na2CO3溶液中。在600 nm波長處測定OD值,以Na2CO3溶液作為空白對(duì)照。接著將小鼠斷頸脫臼致死,小心解剖取動(dòng)物肝臟、脾臟和胸腺,用濾紙吸干臟器表面血污,分別稱質(zhì)量,計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù),按式(1)計(jì)算吞噬指數(shù)α以反映小鼠碳廓清能力。
1.3.5.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的測定
末次灌胃2 h后,將各組小鼠用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液消毒后,在無菌操作臺(tái)內(nèi)無菌取小鼠脾臟,將脾臟置于裝有冷的無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)的無菌培養(yǎng)皿內(nèi),用1 mL無菌注射器吸取PBS,將針頭刺入脾臟內(nèi)反復(fù)用PBS吹打,直至脾臟薄如蟬翼狀并發(fā)白后停止,得到的液體即為淋巴細(xì)胞懸液,用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)后,再用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL,以1 mL/孔接種于24 孔板,同時(shí)用7.5 μg/mL ConA刺激(測試孔),以不加ConA作為非刺激孔(空白孔)。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h后,加入5 mg/mL MTT(50 μL/孔),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出;加入二甲基亞砜溶液600 μL,振蕩數(shù)次后于室溫暗處放置15 min,用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定吸光度,以測試孔與空白孔OD值的差值表示脾淋巴細(xì)胞增殖能力。
1.3.5.3 血清溶血素水平的測定
豚鼠補(bǔ)體制備:取5 只豚鼠,以無菌操作采集血液,采集好的血液置于4 ℃冰箱過夜,次日離心分離血清即可分離到補(bǔ)體。取5 mL豚鼠血清加入1 mL壓積綿羊紅細(xì)胞(sheep red blood cells,SRBC),水平放置于4 ℃冰箱內(nèi)吸附30 min后離心取上清液,將上清液置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
用半數(shù)溶血值(half hemolysis value,HC50)法測定各組小鼠的血清溶血素水平。末次灌胃2 h后,各組小鼠于腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% SRBC懸液0.2 mL。正常飼喂4 d,然后采血并分離血清,將血清用無菌生理鹽水稀釋200 倍體積。取干凈試管,向其中依次加入稀釋后的血清1 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% SRBC 0.5 mL和生理鹽水稀釋10 倍體積的補(bǔ)體1 mL,混合均勻,同時(shí)設(shè)定無血清管作為對(duì)照管,于37 ℃水浴30 min后,用冰水浴終止反應(yīng)。離心,取1 mL上清液與3 mL都氏試劑混合均勻,同時(shí)取0.25 mL 10% SRBC懸液加都氏試劑至4 mL,充分混勻作為半數(shù)溶血管。放置10 min后,以對(duì)照管為空白,測定各樣品管在540 nm波長處的OD值,按式(2)計(jì)算HC50。
1.3.5.4 NK細(xì)胞活性的測定
實(shí)驗(yàn)前將靶細(xì)胞K562進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng),Hanks液洗滌2 次,計(jì)數(shù),用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL。末次灌胃2 h后,每組小鼠中選取5 只,按照1.3.5.2節(jié)方法制備效應(yīng)細(xì)胞K592,調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×107個(gè)/mL后加入96 孔板,每孔100 μL。將靶細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞=50∶1)加入高、中、低劑量組實(shí)驗(yàn)孔,每孔100 μL;自然釋放孔加入100 μL培養(yǎng)液;最大釋放孔加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% NP40。37 ℃培養(yǎng)4 h,離心,取上清液100 μL置于96 孔酶標(biāo)板中,加入LDH基質(zhì)液100 μL,反應(yīng)8 min,以30 μL 1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定OD值。自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞活性按式(3)計(jì)算。
采用UPLC-HRMS/MS對(duì)甜菜汁進(jìn)行全掃描后,提取m/z 551,在保留時(shí)間分別為9.38、11.17 min處檢測到2 個(gè)色譜峰(圖1)。保留時(shí)間為9.38 min時(shí),對(duì)一級(jí)質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子峰進(jìn)行分析(圖2),結(jié)合文獻(xiàn)[11]對(duì)比,驗(yàn)證其為甜菜紅苷(C24H26N2O13)。保留時(shí)間為11.17 min的化合物結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。
圖1 甜菜紅素的離子色譜圖(m/z 551)Fig. 1 Ion chromatogram of betalain (m/z 551)
圖2 甜菜紅苷的質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectrum of betagin
表1 甜菜紅素對(duì)小鼠血清GSH-Px、SOD活力及MDA濃度的影響Table 1 Effect of betalain on GSH-Px, SOD activity and MDA levels in serum of mice
從表1中可以看出,與空白組比較,甜菜紅素各劑量組均能提高小鼠血清中的GSH-Px活力,其中,中劑量組效果最顯著(P<0.01),高、低劑量組效果相對(duì)較差(P<0.05)。高、中、低劑量組與空白組相比SOD活力均顯著提高,其中,中劑量組效果較好。與空白組相比,高、中劑量組均能顯著降低小鼠血清中MDA濃度(P<0.05),但低劑量組沒有顯著性影響。
表2 甜菜紅素對(duì)小鼠免疫器官臟器指數(shù)及吞噬指數(shù)的影響Table 2 Effects of betalain on spleen and thymus indices and macrophage phagocytosis index in mice
從表2可以看出,與空白組比較,甜菜紅素各劑量組均能提高小鼠胸腺指數(shù),其中,中劑量組效果最好(P<0.01),高、低劑量組效果相對(duì)較差(P<0.05);低劑量組小鼠脾臟指數(shù)無顯著變化,高、中劑量組均顯著提高(P<0.05);低劑量組吞噬指數(shù)無顯著變化,高、中劑量組均顯著提高(P<0.05),且中劑量組效果更好。
表3 甜菜紅素對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞活性、血清溶血素水平的影響Table 3 Effects of betalain on lymphocyte proliferation and NK cell activity as well as serum hemolysin in mice
從表3可以看出,與空白組比較,甜菜紅素各劑量組均能提高小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞活性和血清溶血素水平,其中高、中劑量組效果顯著(P<0.05),低劑量組雖然高于空白組,但差異不顯著。本研究結(jié)果說明高、中劑量甜菜紅素能增強(qiáng)小鼠抗體生成能力。
免疫是一種機(jī)體識(shí)別“自己”、“非己”并排除異己物質(zhì),從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡的生理功能,具有維持自身穩(wěn)定、免疫監(jiān)視和免疫防御的重要作用。免疫系統(tǒng)包括固有免疫和適應(yīng)性免疫,是人類對(duì)抗感染首要的防御系統(tǒng)。同時(shí),它也是衡量人的健康和長壽的一個(gè)指標(biāo)。然而,壓力、疲勞、化療和輻射會(huì)引起免疫抑制[12]。
同時(shí),一些巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖的有絲分裂活動(dòng)與活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生密切相關(guān)[13]。ROS的過度積累會(huì)對(duì)免疫細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響。比如,它們會(huì)通過氧化膜脂和加速GSH-Px的消耗影響細(xì)胞成分,最終導(dǎo)致氧化損傷和免疫抑制[14]。許多研究表明,天然食品中含有豐富的生物活性物質(zhì),能夠中和ROS,從而保護(hù)生物體免受氧化損傷,增強(qiáng)免疫功能。近年來,由于甜菜紅素具有藥理活性,已經(jīng)引起了人們的更多關(guān)注。本研究在前期對(duì)甜菜紅素的提取及抗腫瘤作用研究[15-16]的基礎(chǔ)上,開展了甜菜紅素的體內(nèi)抗氧化和免疫調(diào)節(jié)的研究。
適應(yīng)性免疫包括體液和細(xì)胞免疫,主要為依賴T、B淋巴細(xì)胞的免疫活動(dòng)。研究外來抗原免疫后的抗體反應(yīng)是一種重要的免疫功能檢測方法[17]。利用SRBC免疫小鼠時(shí),B淋巴細(xì)胞可以分泌產(chǎn)生溶血素,血清中溶血素的水平可以用來評(píng)價(jià)機(jī)體的體液免疫狀態(tài)。
T淋巴細(xì)胞的免疫功能活性可以通過其排除靶細(xì)胞、產(chǎn)生各種細(xì)胞因子以及增殖活動(dòng)等指標(biāo)反映,進(jìn)而評(píng)價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)。在本研究中,血清溶血素和利用ConA刺激的淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)可用于闡明甜菜紅素對(duì)適應(yīng)性免疫的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白組比較,高、中劑量甜菜紅素能顯著增加血清溶血素水平(P<0.05),并顯著增強(qiáng)小鼠的淋巴細(xì)胞增殖能力(P<0.05)。給KM小鼠灌胃甜菜紅素后,小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫水平均明顯提高,其中中劑量組效果最明顯。
SBRC作為抗原刺激T、B淋巴細(xì)胞的反應(yīng),需要巨噬細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞的共同作用。巨噬細(xì)胞表面有多種模式識(shí)別受體、細(xì)胞因子受體和調(diào)理性受體,具有直接殺傷胞內(nèi)寄生菌、加工處理提呈抗原[18]、啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答以及自身分泌細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)等作用。因此,本實(shí)驗(yàn)研究了甜菜紅素對(duì)KM小鼠碳廓清能力的影響,結(jié)果表明,中劑量甜菜紅素對(duì)小鼠吞噬能力的提高效果最好,高劑量組效果不及中劑量組,這種情況可能是因?yàn)榫奘杉?xì)胞在將抗原加工和提呈給T、B淋巴細(xì)胞的過程中,甜菜紅素劑量增加可能會(huì)下調(diào)巨噬細(xì)胞的功能,進(jìn)而影響其對(duì)抗原加工處理的作用。
胸腺和脾臟是淋巴細(xì)胞分化、成熟和定居的場所,高、中劑量甜菜紅素能顯著提高胸腺和脾臟指數(shù),說明甜菜紅素通過影響免疫器官指數(shù)影響淋巴細(xì)胞的作用,推測甜菜紅素能夠提高小鼠適應(yīng)性免疫功能。
除了適應(yīng)性免疫功能以外,固有免疫功能在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中同樣具有重要作用。NK細(xì)胞屬于固有免疫細(xì)胞,在固有免疫中扮演重要角色,NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞時(shí)既不需要特異性抗體參與,又不需要抗原預(yù)先致敏淋巴細(xì)胞。NK細(xì)胞在抗腫瘤和抗感染免疫中發(fā)揮重要作用,其活性的控制是通過NK細(xì)胞表面受體的表達(dá)及靶細(xì)胞表面配體的呈現(xiàn)共同作用調(diào)節(jié)[19]。目前,K562細(xì)胞是常被用于評(píng)價(jià)NK細(xì)胞活性的靶細(xì)胞,本研究結(jié)果表明,與空白組比較,高、中劑量甜菜紅素能顯著提高NK細(xì)胞的活性(P<0.05),說明甜菜紅素增加了NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性,進(jìn)一步說明甜菜紅素提高了小鼠的固有免疫水平。有研究表明,NK細(xì)胞不僅能夠識(shí)別、殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞,同時(shí)能夠調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞分泌趨化因子和細(xì)胞因子,比如干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α等[20]。因此,今后可以利用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測定檢測甜菜紅素對(duì)這些細(xì)胞因子的作用,從而更全面地了解甜菜紅素對(duì)NK細(xì)胞活性的影響。
很多研究數(shù)據(jù)證明,氧化應(yīng)激機(jī)制在降低免疫系統(tǒng)的生理功能中有促進(jìn)作用[21]。免疫細(xì)胞和免疫器官對(duì)氧化應(yīng)激十分敏感[22],同樣地,免疫反應(yīng)一般也會(huì)產(chǎn)生ROS,尤其是由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞刺激產(chǎn)生的“呼吸性爆裂”更明顯??寡趸瘎┰谇宄齊OS中扮演了重要角色,其可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷和保持正常功能??寡趸瘎?duì)體外和體內(nèi)免疫功能的有益作用已經(jīng)被證實(shí)。有研究報(bào)道,抗壞血酸的消耗能夠損害NK細(xì)胞的活性[23]。另有研究表明,N-乙酰半胱氨酸和VE能夠平衡免疫功能的改變[24],這些研究均表明抗氧化作用與免疫作用密切相關(guān)。為了避免氧化應(yīng)激,多種抗氧化防御機(jī)制可有效消除ROS,在導(dǎo)致大分子氧化之前,抗氧化酶是最有效的防御機(jī)制之一,能中和ROS的主要酶有SOD、GSH-Px和過氧化氫酶。MDA是脂質(zhì)過氧化的分解產(chǎn)物,其濃度反映了細(xì)胞膜受損害的程度[25]。有研究表明,提高輻射小鼠腦組織、血液及肝臟中SOD和GSH-Px的活性、降低MDA的含量,可以達(dá)到抗輻射作用[26]。另有研究表明,通過降低由輻射、噪聲引起的MDA濃度升高,提高血清SOD、GSH-Px活性,可以使造血器官脾臟和免疫器官胸腺的臟器指數(shù)增加[12,27-28]。這些研究結(jié)果說明抗氧化能力的提高可能會(huì)提高免疫功能,進(jìn)而提高機(jī)體對(duì)抗外界的應(yīng)激能力。本研究結(jié)果表明,甜菜紅素能顯著提高KM小鼠血清中SOD、GSH-Px活力,并顯著降低血清中MDA濃度,說明甜菜紅素對(duì)免疫調(diào)節(jié)作用的影響可能與其抗氧化活性有關(guān)。
綜上,甜菜紅素能明顯起到免疫調(diào)節(jié)的作用,同時(shí),其抗氧化活性有助于增強(qiáng)小鼠的免疫作用。因此,甜菜紅素能夠有效地改善人體的健康和免疫功能。本研究結(jié)合甜菜紅素抗氧化及免疫功能,為開發(fā)甜菜紅素作為保健品并推向臨床應(yīng)用提供參考。