施冰，馮振龍，趙永歧，朱玲玲，李俊峽

(1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心心內(nèi)科，北京 100700；2.軍事科學(xué)院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所)

在缺氧條件下，p38MAPK可被磷酸化活化，通過(guò)磷酸化活化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控特定基因表達(dá)，進(jìn)而將信號(hào)從細(xì)胞外傳導(dǎo)到細(xì)胞核，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。p38MAPK信號(hào)通路參與了腦水腫的信號(hào)傳導(dǎo)。小分子化合物SB203580是p38 MAPK通路特異性抑制劑,具有抗缺氧、減輕炎性反應(yīng)等作用。前期研究中，課題組通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)SB203580具有潛在的防治急性高原反應(yīng)的功能。本研究運(yùn)用綜合實(shí)驗(yàn)艙模擬海拔7000 m高原低氧環(huán)境，探索SB203580防治急性高原低氧大鼠腦水腫的效果及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型構(gòu)建與實(shí)驗(yàn)分組 選用成年健康六周齡SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，雄性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過(guò)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)審核。采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為高原低壓低氧實(shí)驗(yàn)組(HH組)、SB203580干預(yù)組(SB組)和常壓常氧對(duì)照組(con組)。每組18只動(dòng)物。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)艙(貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司)模擬高原低壓低氧條件。實(shí)驗(yàn)艙參數(shù)設(shè)定：模擬海拔高度7000 m，升降速度10 m/s，艙內(nèi)壓力56 kPa，艙內(nèi)氧氣壓力8.6 kPa,艙內(nèi)溫度22.8 ℃，艙內(nèi)濕度24%RH。HH組和SB組的大鼠置于低氧實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)艙運(yùn)行時(shí)間23 h/d。每日開(kāi)倉(cāng)1 h用于更換墊料、飼料和飲用水。晝夜比12 h∶12 h。Con組大鼠置于實(shí)驗(yàn)艙外飼養(yǎng)，處理等同于實(shí)驗(yàn)組大鼠。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及處置方法 SB203580和DMSO購(gòu)自sigma公司。DMSO配置為20 mM儲(chǔ)備液，SB203580溶于30%DMSO中配置成溶液。SB203580溶液于每天開(kāi)倉(cāng)時(shí)進(jìn)行腹腔注射，根據(jù)大鼠體質(zhì)量計(jì)算SB203580溶液注射量(10 mg/kg)。每日注射1次，每只大鼠連續(xù)注射7 d。

1.3 腦組織含水量檢測(cè) 各組大鼠完成實(shí)驗(yàn)后，腹腔麻醉注射處死。剖開(kāi)顱骨，無(wú)菌條件下取出全腦，濾紙吸干。用電子天平稱量全腦濕質(zhì)量后，置于120 ℃恒溫干燥箱烘干24 h 至恒質(zhì)量，稱重腦組織干質(zhì)量。計(jì)算腦組織含水量=(濕重-干重) /濕重×100%。

1.4 腦組織病理檢測(cè) 各組大鼠完成實(shí)驗(yàn)后，腹腔麻醉注射處死。剖開(kāi)顱骨，無(wú)菌條件下取出全腦，濾紙吸干。腦組織用40 mL/L多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切5片，片厚約4 μm，HE染色，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察病理變化。

1.5 腦組織AQP1 和AQP4 mRNA檢測(cè) 應(yīng)用real time PCR檢測(cè)各組大鼠腦組織AQP1和AQP4mRNA表達(dá)。選取100mg腦組織標(biāo)本，采用Trizol法提取組織總RNA。通過(guò)Reverse Transcription Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用熒光定量PCR試劑盒對(duì)AQP1和AQP4mRNA進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)總體系為25 μL(其中上下游引物各0.5 μL、Premix 12.5 μL,cDNA模板2 μL、ddH2O 9.5 μL)。PCR程序參照試劑盒中提供的兩步法檢測(cè):95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用AQP4和β-actin循環(huán)閾值(CT)之差(ΔCt)計(jì)算得到相關(guān)基因的表達(dá)情況,計(jì)算對(duì)比的樣本間基因表達(dá)的差異(ΔΔCt)。以β-actin作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量,以對(duì)照組的RQ值為1,各組是相對(duì)于1的變化倍數(shù)。引物由上海生工合成。各基因擴(kuò)增的上下游引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因擴(kuò)增的上下游引物序列

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織含水量測(cè)定結(jié)果 與對(duì)照組[(70.15±3.32)%,n=6]比較，HH組大鼠腦組織含水量[(77.83±0.30)%,n=6]顯著升高(P<0.05),而SB組大鼠腦組織含水量[(76.66±0.32)%,n=6]差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與HH組比較，SB組大鼠腦組織含水量顯著降低(P<0.05)。提示SB203580可減輕高原低氧大鼠腦水腫。

2.2 腦組織AQP1和AQP4mRNA檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組比較，HH組大鼠腦組織AQP1mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，SB203580組大鼠腦組織AQP1mRNA表達(dá)量未見(jiàn)顯著變化(P>0.05)。與低氧組比較，SB203580組大鼠腦組織AQP1mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.01)(表2)。提示SB203580可下調(diào)高原低氧大鼠腦組織AQP1mRNA表達(dá)。

與對(duì)照組比較，HH組大鼠腦組織AQP4mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，SB203580組大鼠腦組織AQP4mRNA表達(dá)量未見(jiàn)顯著變化(P>0.05)。與低氧組比較，SB203580組大鼠腦組織AQP4mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.01)(表2)。提示SB203580可下調(diào)高原低氧大鼠腦組織AQP4mRNA表達(dá)。

2.3 大鼠腦組織病理變化 腦組織HE染色病理切片提示，對(duì)照組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊。低氧組大鼠腦組織神經(jīng)元排列紊亂，細(xì)胞減少，血管擴(kuò)張。血管、神經(jīng)細(xì)胞周?chē)g歇增大。與低氧組比較，SB203580組大鼠腦組織損傷程度較輕(圖1)。

3 討論

當(dāng)機(jī)體暴露于高原低壓低氧條件下時(shí)，腦和心臟作為需氧量較大的組織器官，對(duì)環(huán)境中氧分壓的改變十分敏感，故而造成的損傷也較為明顯[1-2]。腦損傷后炎性物質(zhì)與氧化自由基等物質(zhì)在腦組織的繼發(fā)性損傷中起著重要的作用。腦水腫是腦缺氧后腦組織繼發(fā)性損傷的主要表現(xiàn)之一。雖然許多學(xué)者對(duì)腦水腫的產(chǎn)生機(jī)制此作了大量實(shí)驗(yàn)和臨床研究，但其具體的病理生物學(xué)機(jī)制尚未完全闡明。水通道蛋白(AQP) 是一類(lèi)廣泛分布于機(jī)體不同組織器官中的特異性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水的膜蛋白，共有13個(gè)亞型?？梢源龠M(jìn)水分子的快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓力的平衡。在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的水通道蛋白有AQP1、3、4、5、8、9等6個(gè)亞型。其中AQP1、AQP4在腦組織表達(dá)較多,在腦外傷、腦出血、腦腫瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變時(shí)表達(dá)增加,參與腦水腫形成。

AQP1主要集中表達(dá)于側(cè)腦室、第四腦室及第三腦室的脈絡(luò)叢上,參與腦脊液的生成和調(diào)節(jié),并參與水和離子的平衡[3]。AQP4 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要水通道蛋白，在腦組織水平衡的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[4]。AQP4在正常腦組織中呈極性分布,主要位于血管周?chē)男切渭?xì)胞足突處,靠近神經(jīng)元側(cè)足突表達(dá)較少。這種分布模式有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞與血管間水的轉(zhuǎn)運(yùn)。AQP4的高表達(dá)與細(xì)胞毒性腦水腫程度呈正相關(guān)[5]。腦缺氧時(shí)，AQP4在血管側(cè)分布減少,而在神經(jīng)元側(cè)分布增加,這種極性改變導(dǎo)致過(guò)多的水分子滯留在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)造成細(xì)胞腫脹，導(dǎo)致腦水腫發(fā)生。因此，調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4的表達(dá)可減輕腦水腫程度[6-7]。適時(shí)、正確地干預(yù)AQP4的表達(dá)變化可能為有效控制腦水腫的發(fā)生發(fā)展提供新思路。

SB203580是一種常用p38MAPK抑制劑，可以通透細(xì)胞，抑制p38MAPK激活，進(jìn)而有效抑制一些炎性因子(如IL-1β、TNF-α)介導(dǎo)的部分信號(hào)傳導(dǎo)。SB203580作為一種新型生物制劑，目前已被廣泛應(yīng)用于多種疾病治療的研究領(lǐng)域。本研究發(fā)現(xiàn)，與常壓常氧對(duì)照組相比，低壓低氧組大鼠腦組織中AQP1及AQP4mRNA表達(dá)增高且伴腦組織含水量增加。提示在高原低氧環(huán)境下，大鼠腦組織缺氧后P38信號(hào)通路被激活，致使AQP1和AQP4高表達(dá)，進(jìn)而增加腦含水量。以往研究發(fā)現(xiàn)，阻斷p38的激活可以降低星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧模型中AQP1及AQP4mRNA表達(dá)[8]，減輕大鼠腦創(chuàng)傷后腦水腫程度。本研究發(fā)現(xiàn)，與低氧組相比，SB203580組大鼠腦組織AQP1和AQP4mRNA的表達(dá)顯著降低伴腦含水量減少。提示SB203580可靶向抑制AQP1和AQP4的激活，導(dǎo)致AQP1和AQP4表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而減少腦含水量，具有抗高原低氧腦水腫的效果。本實(shí)驗(yàn)研究為急性高原病的預(yù)防和治療提供了新的干預(yù)策略和干預(yù)靶點(diǎn)。

表2 SB203580對(duì)大鼠腦組織AQP1mRNA和AQP4mRNA表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01;與HH組比較，bP<0.01

圖1 SB203580對(duì)高原低氧腦組織病理學(xué)改變的影響 (HE染色) 。A：對(duì)照組，B：HH組，C：SB203580組