侯靜華，劉占峰，杜曉寧，宋明鳴

(上?；ぱ芯吭河邢薰?上海穩(wěn)定同位素工程技術(shù)研究中心，上海 200062)

近年來，隨著穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)的發(fā)展及質(zhì)譜等檢測手段的不斷完善，蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、精準醫(yī)療等研究的需要以及其他相關(guān)科學(xué)的快速發(fā)展，13C標記、15N標記以及13C、15N雙標記的氨基酸得到越來越廣泛的應(yīng)用。13C、15N穩(wěn)定同位素標記的氨基酸在生物醫(yī)學(xué)、定量蛋白質(zhì)組學(xué)等研究如SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cell culture)應(yīng)用中具有高通量、同位素標記效率高、靈敏度高等優(yōu)勢，也用來示蹤測定氨基酸代謝的各類動態(tài)參數(shù)、蛋白質(zhì)的合成速率及結(jié)構(gòu)等[1]?？梢婇_發(fā)穩(wěn)定同位素多標記氨基酸新品種勢在必然。2018年第1期《Nature Protocols》報道，13C、15N雙標記的L-賴氨酸等可進行復(fù)雜蛋白質(zhì)組的分析[2]，因此，開發(fā)13C、15N雙標記的L-賴氨酸很有意義。

L-賴氨酸(lysine)的化學(xué)名稱為2,6二氨基己酸，在醫(yī)藥、食品、飼料工業(yè)等方面有著廣泛的應(yīng)用。L-賴氨酸是人體和動物所不能合成的8種必需氨基酸中最重要的一種，最初從蛋白質(zhì)水解物中分離得到，之后其制備方法又出現(xiàn)了化學(xué)合成法、酶法。1960年日本首先使用發(fā)酵法生產(chǎn)，我國于20世紀60年代中期開始進行賴氨酸菌株選育和發(fā)酵研究。目前，L-賴氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)方法主要有蛋白水解法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法[3-5]，世界約2/3的賴氨酸企業(yè)采用發(fā)酵法生產(chǎn)L-賴氨酸。而對于制備穩(wěn)定同位素標記的L-賴氨酸，最適合的方法是微生物發(fā)酵法。

關(guān)于13C、15N雙標記的L-賴氨酸鹽酸鹽的應(yīng)用文獻不少，但制備方面鮮有文獻報道。本研究利用L-賴氨酸產(chǎn)生菌之北京棒桿菌(Corynebacteriumpekinense)以發(fā)酵法研制13C、15N雙標記的L-賴氨酸鹽酸鹽，得到了高豐度的雙標記產(chǎn)品，豐度及收率都較高，有望繼續(xù)用以擴大制備。

1 實驗材料

1.1 實驗菌株

L-賴氨酸產(chǎn)生菌ZLD118(HS-、AECr)，由北京棒桿菌(Corynebacteriumpekinense)As1.563選育而來，本實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，NaCl 5.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，硫酸銨5 g/L，K2HPO41.0 g/L，MgSO40.25 g/L，玉米漿5～10 mL/L，pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基： 葡萄糖130 g/L，硫酸銨40 g/L，MgSO40.25 g/L， K2HPO41.0 g/L，生物素500 μg/L，鹽酸硫胺500 μg/L，高絲氨酸0.20 g/L，玉米漿10 mL/L，MnSO4·4H2O 0.02 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g/L，CaCO330 g/L，pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌 15 min。

1.3 主要試劑

D-葡萄糖-13C6，豐度99%，美國進口；(15NH4)2SO4，豐度99.14%，上海化工研究院有限公司出品。其他主要試劑為生化級或分析純級，由國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司及上海凌峰化學(xué)試劑有限公司出品。

1.4 主要儀器

ZHWY-1112型恒溫振蕩器：上海智城分析儀器廠；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠； PB-21酸度計：賽多利斯公司；756MC型分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SBA-40C型生物傳感儀：山東省科學(xué)院生物研究所；LCMS 2020液質(zhì)聯(lián)用儀：日本島津公司；MAT-271型氣體同位素質(zhì)譜儀： 德國Finnigan公司。

2 實驗方法

2.1 菌種的斜面培養(yǎng)

將菌種轉(zhuǎn)接至活化斜面，32 ℃活化培養(yǎng)20～24 h。

2.2 種子培養(yǎng)

將新鮮活化后的斜面菌體一環(huán)接入裝有20 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中， 32 ℃，200 r/min培養(yǎng)12～16 h。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為500 mL三角瓶裝25 mL,32 ℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)96 h。

2.4 分析方法

1) pH測定：用精密pH試紙和pH計測定。

2) 葡萄糖測定：采用SBA-40C型生物傳感儀。

3)L-賴氨酸測定：定性測定用紙層析法[6]。定量測定用酸性茚三酮比色法[7]：發(fā)酵液離心后取上清液0.1 mL稀釋至100 mL, 吸取1 mL稀釋液加入4 mL茚三酮試劑于試管中, 沸水浴加熱20 min, 快速冷卻后用756型分光光度計在478 nm處比色。根據(jù)標準曲線確定發(fā)酵液中L-賴氨酸產(chǎn)量。

4) 產(chǎn)品純度分析：HPLC法和LC-MS法。

5) 產(chǎn)品豐度分析：MAT-271型質(zhì)譜儀測定，微量轉(zhuǎn)化法。

3 結(jié)果與討論

菌體的發(fā)酵培養(yǎng)受多個發(fā)酵條件、多種發(fā)酵因素的影響。本研究將對發(fā)酵培養(yǎng)條件、發(fā)酵培養(yǎng)基配方通過一系列條件實驗進行優(yōu)化。對發(fā)酵培養(yǎng)條件中的種子培養(yǎng)時間、發(fā)酵初始pH、發(fā)酵裝液量、發(fā)酵溫度等對菌種產(chǎn)酸的影響進行條件實驗；對發(fā)酵培養(yǎng)基配方中的葡萄糖、硫酸銨、高絲氨酸、碳酸鈣等成分，通過正交實驗來確定最佳配比。

3.1 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

3.1.1種子液培養(yǎng)時間

種子培養(yǎng)時間即種齡，是指種子液中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子瓶(罐)或發(fā)酵瓶(罐)時培養(yǎng)時間。選擇適當?shù)姆N齡非常重要，太年輕或過老的種子都對發(fā)酵不利。一般選擇種齡在對數(shù)生長期后期，即培養(yǎng)液中菌濃接近高峰時所需的時間為宜[8]。

實驗選取新鮮活化斜面菌種一環(huán)于(20 mL/250 mL三角瓶)種子培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 震蕩培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，稀釋20倍后用756MC型分光光度計于620 nm、光程1 cm測量OD620值，結(jié)果示于圖1。由圖1可知，賴氨酸產(chǎn)生菌在培養(yǎng)4 h后即開始進入對數(shù)生長期，在培養(yǎng)16 h后基本達到對數(shù)生長末期，之后即進入穩(wěn)定生長期。因此選取種子培養(yǎng)12～16 h。

3.1.2發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酸的影響

pH是代謝活動的綜合指標，其變化會影響各種酶活、菌對基質(zhì)的利用速率和細胞的結(jié)構(gòu)，從而影響菌的生長和產(chǎn)物的合成，尤其是在產(chǎn)氨基酸的微生物中pH的影響非常重要[9]。本研究將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)在6.8～7.2，等間距設(shè)了4個點，發(fā)酵結(jié)果列于表1。

圖1 ZLD118生長曲線Fig.1 The growth curve of ZLD118

pH 6.87.07.27.4Lys.HCl/(g·L-1)39.8745.5647.9342.49

注：產(chǎn)量以賴氨酸的鹽酸鹽計(Lys.HCl)

由表1可見，pH 6.8時產(chǎn)酸最低，pH 7.0產(chǎn)酸上升明顯，pH 7.2產(chǎn)酸繼續(xù)上升，到pH 7.4產(chǎn)酸下降，因此，較佳的發(fā)酵初始pH為 7.0～7.2。pH過高過低都會影響菌體的生長、酶的活性以及引起菌體代謝途徑的改變，進而影響目的產(chǎn)物的生成。因此本株L-賴氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH以7.2為最佳。

3.1.3不同瓶子的裝液量對發(fā)酵的影響

搖瓶發(fā)酵過程的供氧主要取決于裝液量和轉(zhuǎn)速，L-賴氨酸產(chǎn)生菌是好氧微生物，只有當培養(yǎng)液中溶解氧濃度大于菌的臨界濃度，菌體呼吸才能得到滿足。在賴氨酸發(fā)酵過程中當氧供給能滿足菌體的呼吸，產(chǎn)酸量即可達到最大值。針對實驗室不同品種的500 mL三角瓶，為找出不同瓶子對發(fā)酵的差異性，得到優(yōu)選的瓶子及裝液條件，進行不同瓶子的裝液量發(fā)酵實驗，結(jié)果列于表2。

由表2結(jié)果知，裝液量對發(fā)酵產(chǎn)酸的影響較大，不同瓶子間不同裝液量的產(chǎn)酸差異更大。3種規(guī)格的瓶子“GG17”和“95”在結(jié)構(gòu)尺寸上非常接近，瓶子高度、瓶口內(nèi)徑、瓶底外徑都一樣，唯一不同的是瓶頸高度“GG17”比“95”高13 mm，而“華鷗”的瓶子4個尺寸比另外2個都小，達不到L-賴氨酸產(chǎn)生菌供氧的要求，所以產(chǎn)酸最低。而“GG17”瓶頸比“95”高，供氧更好，因此產(chǎn)酸最高。20 mL裝液量時通風(fēng)量大，菌體生長快、耗糖過快，而30、35 mL裝液量下則通風(fēng)量過小，菌體生長慢且不足，耗糖也慢,兩者明顯影響菌株的產(chǎn)酸率。25 mL裝液量的通風(fēng)量較為適宜，因此任何一種瓶子的25 mL裝液量產(chǎn)酸都最高，而GG17瓶子不管在何種裝液量條件下在3種瓶子中產(chǎn)酸都最高，故最終采用GG17瓶子25 mL裝液量的發(fā)酵條件。

表2 不同瓶子的裝液量對L-賴氨酸發(fā)酵的影響Table 2 Effect of medium volumn on L-Lysine fermentation for different flask

3.1.4發(fā)酵溫度對產(chǎn)L-賴氨酸的影響

圖2 溫度對L-賴氨酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of temperature on L-Lysine production

溫度會影響各種酶活，直接影響發(fā)酵過程的反應(yīng)速率，并且還通過改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)而間接影響產(chǎn)物的合成。本研究分別采用5個不同的培養(yǎng)溫度28、30、32、34、36 ℃來考察溫度對菌株ZLD118的L-賴氨酸產(chǎn)量的影響(圖2)。

由圖2結(jié)果可知，當溫度從28 ℃遞增到32 ℃時，L-賴氨酸的產(chǎn)量隨著溫度的升高而逐漸增加，溫度為32 ℃時，L-賴氨酸產(chǎn)量達到最大值；隨著溫度的進一步上升，L-賴氨酸產(chǎn)量有所降低，而36 ℃比34 ℃更低。當溫度低于30 ℃時，可能因菌體生長緩慢，使得L-賴氨酸產(chǎn)量下降；溫度高于34 ℃，即可能因為溫度升高使酶反應(yīng)速率加大、生長代謝更快，導(dǎo)致生產(chǎn)期縮短，也可能因為酶本身過熱失活，導(dǎo)致菌體衰老發(fā)酵周期提前而改變最終產(chǎn)量。由此，選擇32 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

本發(fā)酵培養(yǎng)基由于要用來制備13C、15N雙標記的產(chǎn)品，因此碳源采用葡萄糖、氮源采用硫酸銨，是為了分別可以用13C、15N標記碳源、氮源原料。發(fā)酵培養(yǎng)基中的重要成分為葡萄糖、硫酸銨、高絲氨酸和碳酸鈣，擬通過正交試驗確定配比。

表3 L9(34)正交實驗表及結(jié)果Table 3 L9(34) orthogonal list and the result of test

在該最佳條件下進行驗證試驗，Lys.HCl產(chǎn)量達到48.97 g/L，證實了A3B2C2D2為最佳組合條件，將用于穩(wěn)定同位素13C、15N高豐度發(fā)酵以制備產(chǎn)品。

3.3 高豐度實驗及產(chǎn)品的表征

3.3.1高豐度實驗及結(jié)果

根據(jù)上述試驗獲得的較佳發(fā)酵條件，配制13C、15N雙標記高豐度發(fā)酵培養(yǎng)基進行高豐度實驗，并對所得發(fā)酵液進行分離提取精制得到雙標記的高豐度產(chǎn)品。

發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液調(diào)pH至4左右進行離心，上清液上732銨型樹脂柱，水洗后用0.10 mol/L的氨水溶液洗脫，自動收集L-賴氨酸單斑洗脫液，真空濃縮趕氨。趕氨完畢，加水溶解成溶液，用鹽酸調(diào)pH至4.9～5.0，加活性炭脫色，所得濾液經(jīng)真空濃縮至有結(jié)晶開始析出即加入乙醇結(jié)晶。結(jié)晶液冷藏過夜，經(jīng)抽濾得到白色晶體， 60 ℃真空干燥，得到L-賴氨酸鹽酸鹽-13C6、15N2產(chǎn)品，結(jié)果列于表4。

表4 高豐度實驗結(jié)果Table 4 Results of high abundance fermentation and extraction

由表4可知，產(chǎn)品13C、15N的豐度值都很好，豐度下降值小尤其是13C的豐度下降更小，純度達98.47%，后續(xù)工作提高菌種產(chǎn)酸，優(yōu)化相關(guān)工藝條件并適當放大將有更好的市場競爭力。

3.3.2產(chǎn)品表征

13C、15N雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽高豐度產(chǎn)品的HPLC及LCMS譜圖示于圖3。

a——HPLC；b——LCMS圖3 L-Lys.HCl-13C6、15N2的液相色譜、質(zhì)譜圖a——HPLC；b——LCMSFig.3 HPLC and MS of L-Lys.HCl-13C6、15N2

本產(chǎn)品的純度經(jīng)HPLC檢測為98.47%，豐度經(jīng)同位素質(zhì)譜儀檢測分別為98.61%13C，98.15%15N。LCMS測L-Lys的相對分子質(zhì)量146，L-Lys-13C6、15N2的相對分子質(zhì)量154，故顯示的分子離子峰為154，在正離子模式下分子離子峰為155，為目標產(chǎn)物。

4 小結(jié)

通過條件優(yōu)化實驗，獲得了較佳的發(fā)酵工藝條件并制備了穩(wěn)定同位素13C、15N雙標記產(chǎn)品。經(jīng)過高豐度發(fā)酵實驗并對發(fā)酵液進行提取精制，產(chǎn)品13C、15N雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的13C和15N豐度分別為98.61%和98.15%，純度為98.47%，產(chǎn)率達88.8%，取得了較好的結(jié)果。關(guān)于用發(fā)酵法制備13C、15N雙標記的L-賴氨酸鹽酸鹽還未見有文獻報道，產(chǎn)品的13C豐度僅下降0.39%，如再對菌種進行技術(shù)處理提高產(chǎn)酸率，以及繼續(xù)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，將使產(chǎn)品的技術(shù)指標進一步提升。