孟凱聞,朱文壯,張 迪,金藝鵬,林德貴,孟 賡

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀100193)

貓杯狀病毒(FCV)是貓科動(dòng)物的常見病原,可通過(guò)口、鼻等途徑感染,主要在口腔和呼吸道組織中增殖,FCV 的單獨(dú)感染或與其他病原的混合感染可引起貓的上呼吸道和口腔病變,臨床見打噴嚏、眼鼻部出血、結(jié)膜炎、口炎、牙齦炎、口腔潰瘍,嚴(yán)重者還會(huì)發(fā)生肺炎、跛行、流產(chǎn)、慢性胃腸炎、皮膚水腫及潰瘍等[1-3]。其中貓口炎是臨床中的常見口腔疾病,已有很多外國(guó)的報(bào)道揭示了貓口炎與FCV 的高度關(guān)聯(lián)性,近年在北京地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查也證明了這一點(diǎn)[4-7]。FCV 與貓皰疹病毒等感染引起的癥狀非常相似,也可引起很多復(fù)雜的非典型癥狀,單從臨床癥狀難以確診病原,還需結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷確診。目前針對(duì)FCV 的實(shí)驗(yàn)室診斷包括病毒分離、核酸檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)。本研究將原核表達(dá)的FCV-VP1 蛋白作為包被抗原,建立檢測(cè)血清中FCV 抗體的間接ELISA 檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 重組表達(dá)質(zhì)粒、細(xì)胞、血清及試劑 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-FCV-VP1;感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3);96份臨床血清由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院、美聯(lián)眾合伴侶動(dòng)物醫(yī)院、北京思誠(chéng)動(dòng)物醫(yī)院、北京健愛緣動(dòng)物醫(yī)院、北京和諧動(dòng)物醫(yī)院、北京天照愛寵動(dòng)物醫(yī)院、北京星輝動(dòng)物醫(yī)院提供,由本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存;HRP 標(biāo)記兔抗貓IgG 購(gòu)自北京博爾西科技有限公司。

1.2 FCV-VP1 抗原的制備 按常規(guī)方法將構(gòu)建的FCV-VP1 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3);將重組表達(dá)菌株37 ℃培養(yǎng),并用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá),將表達(dá)的重組蛋白利用HisTrap HP 親和柱純化。

1.3 間接ELISA 條件優(yōu)化 基本步驟如下:將純化的FCV-VP1 重組蛋白1 μg/mL 4 ℃過(guò)夜包被96孔酶標(biāo)板,PBST 洗板3 次,加封閉液37 ℃封閉2 h,PBST 洗板3 次;加入血清稀釋液100 倍稀釋的待檢血清,37 ℃作用30 min,PBST 洗板3 次,加入酶標(biāo)二抗稀釋液稀釋的HRP 標(biāo)記兔抗貓IgG,37 ℃作用30 min,PBST 洗板3 次,每孔加入100 μL TMB 底物溶液37 ℃顯色10 min,用50 μL 2 mol/L 的硫酸終止反應(yīng),酶標(biāo)儀讀取各孔OD450nm值,計(jì)算陽(yáng)性與陰性血清OD450nm值之比(P/N)。應(yīng)用棋盤法確定各最佳條件。

1.3.1 最佳封閉液的確定以1 μg/mL 的抗原濃度,100 μL/孔包被96 孔酶標(biāo)板,分別以1%BSA、0.05%OVA、1%明膠、5%胎牛血清、5%脫脂奶粉作封閉液,37 ℃封閉2 h,FCV 陽(yáng)性血清作為一抗,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照,加入HRP 標(biāo)記兔抗貓IgG,進(jìn)行常規(guī)ELISA 檢測(cè),酶標(biāo)儀讀取各孔OD450nm值,計(jì)算P/N 值,確定最佳封閉液。

1.3.2 最佳血清稀釋液的確定將樣本血清分別以1%BSA、PBST、5%兔血請(qǐng)、5%胎牛血清按1∶100 稀釋,100 μL/孔加入96 孔酶標(biāo)板反應(yīng),進(jìn)行常規(guī)ELISA 檢測(cè),酶標(biāo)儀讀取各孔OD450nm值,計(jì)算P/N值,確定最佳血清稀釋液。

1.3.3 最佳酶標(biāo)二抗稀釋液的確定將HRP 標(biāo)記兔抗貓IgG 以1%BSA、PBST、5%兔血請(qǐng)、5%胎牛血清稀釋至效價(jià)為1∶10 000,進(jìn)行常規(guī)ELISA 檢測(cè),酶標(biāo)儀讀取各孔OD450nm值,計(jì)算P/N 值,確定最佳酶標(biāo)二抗稀釋液。

1.3.4 最佳酶標(biāo)二抗工作效價(jià)的確定以篩選的最佳酶標(biāo)二抗稀釋液稀釋HRP 標(biāo)記兔抗貓IgG 至效價(jià)為1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000,設(shè)置2 個(gè)重復(fù),進(jìn)行常規(guī)ELISA 檢測(cè),酶標(biāo)儀讀取各孔OD450nm值,計(jì)算P/N 值,確定最佳酶標(biāo)二抗工作效價(jià)。

1.3.5 臨界值的確定對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的32 份FCV陰性血清樣本,以本實(shí)驗(yàn)室建立的間接ELISA 抗體檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算樣本OD450nm值的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué),當(dāng)樣本OD450nm值≥X+3SD 時(shí),判定為陽(yáng)性。

1.4 間接ELISA 方法的特異性 按照上述建立的ELISA 方法,用同一批次的ELISA 檢測(cè)板對(duì)FCV 陽(yáng)性血清及貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(Feline Panleukopenia Virus,FPV)、貓傳染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritionitis Virus,FIPV)、貓白血病病毒(Feline Leukemia Virus,FeLV)、貓免疫缺陷病毒(Feline Immunodefiency Virus,FIV)的陽(yáng)性血清進(jìn)行特異性檢測(cè)。

1.5 間接ELISA 方法的重復(fù)性 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn):按照上述建立的ELISA 方法,用同一批次的ELISA 檢測(cè)板測(cè)定8 份FCV 陽(yáng)性血清,每份血清做3 孔平行,對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,評(píng)估間接ELISA方法的批內(nèi)重復(fù)性。

批間重復(fù)性試驗(yàn):應(yīng)用3 個(gè)不同批次制備的ELISA 檢測(cè)板,測(cè)定8 份FCV 陽(yáng)性血清,對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,評(píng)估間接ELISA 方法的批間重復(fù)性。

1.6 臨床貓血清的檢測(cè)結(jié)果 按照上述建立的ELISA 方法,對(duì)96 份臨床收集的貓血清進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 最佳封閉液的確定 以純化的重組蛋白FCVVP1 1 μg/mL 4 ℃過(guò)夜包被酶標(biāo)板,分別以1%BSA、0.05%OVA、1%明膠、5%胎牛血清、5%脫脂奶粉作封閉液,進(jìn)行ELISA 檢測(cè),結(jié)果顯示(表1),當(dāng)用5%脫脂奶粉封閉時(shí),P/N 值最高,因此選擇5%脫脂奶粉為最佳封閉液。

2.2 最佳血清稀釋液的確定 將樣本血清分別以1%BSA、PBST、5%兔血清、5%胎牛血清按1∶100 稀釋,進(jìn)行ELISA 檢測(cè),結(jié)果顯示(表2),當(dāng)用5%胎牛血清稀釋時(shí),P/N 值最高,因此選擇5%胎牛血清為最佳血清稀釋液。

2.3 最佳酶標(biāo)二抗稀釋液的確定 以1%BSA、PBST、5%兔血清、5%胎牛血清分別稀釋HRP 標(biāo)記兔抗貓IgG,進(jìn)行ELISA 檢測(cè),結(jié)果顯示(表3),當(dāng)用5%兔血清作為酶標(biāo)二抗稀釋液時(shí),P/N值最高,因此選擇5%兔血清為最佳酶標(biāo)二抗稀釋液。

2.4 最佳酶標(biāo)二抗工作效價(jià)的確定 以5%兔血清稀釋HRP 標(biāo)記兔抗貓IgG 至效價(jià)為1 ∶10 000、1∶15 000、1∶20 000,進(jìn)行ELISA 檢測(cè),結(jié)果顯示(表4),當(dāng)效價(jià)為1 ∶20 000 時(shí)P/N 值最高,因此選擇1∶20 000為最佳酶標(biāo)二抗工作效價(jià)。

2.5 臨界值的確定 對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的32 份FCV陰性血清樣本,進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示(見表5),樣本OD450nm值的平均值()為0.068,標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為0.031,因此臨界值為+3SD=0.161,即當(dāng)樣本OD450nm值≥0.161 時(shí)判為陽(yáng)性。

2.6 間接ELISA 方法的特異性 用上述建立的間接ELISA 方法分別對(duì)FPV、FIPV、FeLV、FIV 和FCV的陽(yáng)性血清進(jìn)行測(cè)定,其OD450nm值分別為0.096、0.103、0.074、0.105、1.189,除FCV 陽(yáng)性血清外,其他病毒的陽(yáng)性血清OD450nm值均小于臨界值0.161,表明建立的間接ELISA 方法特異性良好。

2.7 間接ELISA 方法的重復(fù)性 重復(fù)性試驗(yàn)表明,批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均值為4.33%(表6),批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)均值為5.75%(表7)。通過(guò)試驗(yàn)表明,建立的間接ELISA 方法重復(fù)性及穩(wěn)定性良好。

2.8 臨床貓血清的檢測(cè)結(jié)果 用本實(shí)驗(yàn)室建立的檢測(cè)方法對(duì)96 份臨床收集的貓血清進(jìn)行檢測(cè),ELISA 檢測(cè)結(jié)果表明(表8),全部血清樣本中共檢測(cè)出40 份陽(yáng)性血清,貓口炎就診病例陽(yáng)性率為96.3%(26/27),貓口炎無(wú)關(guān)病例陽(yáng)性率20.3%(14/69)。

表1 最佳封閉液的確定

表2 最佳血清稀釋液的確定

表3 最佳酶標(biāo)二抗稀釋液的確定

表4 最佳酶標(biāo)二抗工作效價(jià)的確定

表5 臨界值的確定

表6 間接ELISA 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

表7 間接ELISA 批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

表8 臨床血清樣本的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

FCV 在臨床上可引起貓科動(dòng)物口炎,導(dǎo)致患貓流涎、口腔黏膜紅腫潰爛、口臭、進(jìn)食困難,進(jìn)而厭食消瘦,極大地影響了家養(yǎng)寵物貓及流浪貓的生活質(zhì)量。針對(duì)FCV 的檢測(cè),由于FCV RNA 依賴的RNA 多聚酶缺少校正功能及低保真性,使得病毒的基因組有很高的重塑性極易發(fā)生抗原變異,這為臨床上檢測(cè)FCV 造成了極大困難[1-2]。目前除了常規(guī)的RT-PCR 檢測(cè)方法,尚無(wú)針對(duì)FCV 可用的血清學(xué)商品化快速檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)卡。

FCV 衣殼蛋白VP1 分為NTA、S、P1、P2 等結(jié)構(gòu)域,其編碼基因具有高度保守性,其中病毒顆粒最外表面的P2 結(jié)構(gòu)域是大多數(shù)中和表位所在的區(qū)域,因此可作為疫苗及檢測(cè)試劑盒制備中的首選蛋白[8]。本試驗(yàn)利用已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-FCVVP1,通過(guò)原核表達(dá)獲取FCV-VP1 重組蛋白,以該蛋白作為包被抗原建立了FCV 間接ELISA 抗體檢測(cè)方法,經(jīng)檢驗(yàn)具有良好的特異性,操作簡(jiǎn)便,可重復(fù)性高。

利用本試驗(yàn)建立的ELISA 方法檢測(cè)臨床收集的96 份貓血清,結(jié)果表明,其中40 份呈陽(yáng)性,貓口炎就診病例陽(yáng)性率為96.3%(26/27),貓口炎無(wú)關(guān)病例陽(yáng)性率20.3%(14/69),該結(jié)果與此前報(bào)道的貓杯狀病毒與貓口炎的高度關(guān)聯(lián)性相符合。

本試驗(yàn)成功建立了以原核表達(dá)的FCV-VP1 蛋白為基礎(chǔ)的FCV 間接ELISA 抗體檢測(cè)方法,具有廣泛的應(yīng)用前景。