李麗娜,李欣然,張一鳴,李亞楠,王宇鑫,劉文瀚,陳 宇,高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱150030)

噻拉嗪(Xylazine,商品名為隆朋)是α2-腎上腺素能受體的激動(dòng)藥,具有中樞性鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和肌松等作用[1]。不僅可以單獨(dú)用于動(dòng)物麻醉,而且還可以與其他麻醉劑配合應(yīng)用,均能產(chǎn)生較好的麻醉效果,亦可增強(qiáng)其他麻醉劑的麻醉作用。去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)是興奮性單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì),同屬于兒茶酚胺類(lèi),是動(dòng)物體內(nèi)一類(lèi)非常重要的神經(jīng)遞質(zhì)。 去甲腎上腺素在中樞內(nèi)分布廣泛,含量較多,20 世紀(jì)60 年代初,科學(xué)家將NE 注射腦室內(nèi),發(fā)現(xiàn)能引起動(dòng)物的血壓降低、心跳減慢。有研究表明,腦內(nèi)NE 參與痛覺(jué)的產(chǎn)生,體溫的調(diào)節(jié)和覺(jué)醒的維持,并且引起心率減慢和血壓降低[2-5]。 多巴胺是去甲腎上腺素合成的中間產(chǎn)物。 腦內(nèi)多巴胺的作用是多方面的,在CNS 中DA 可以調(diào)節(jié)肌緊張,其遞質(zhì)釋放是一切行為反應(yīng)的基本條件[6]。腦內(nèi)DA 能夠參與精神活動(dòng)的調(diào)節(jié),垂體內(nèi)分泌和增強(qiáng)疼痛敏感性[7-8]。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究噻拉嗪對(duì)山羊各個(gè)腦區(qū)NE 和DA 含量的影響,利用山羊研究該藥的麻醉中樞作用機(jī)制,以探討噻拉嗪對(duì)山羊麻醉的中樞作用機(jī)制及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要作用位點(diǎn)。為今后噻拉嗪在臨床上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 山羊25 只,臨床檢查健康,體重13~15 kg,雌雄兼用,購(gòu)自哈爾濱市香坊區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng),試驗(yàn)前在動(dòng)物舍喂養(yǎng)1 周以適應(yīng)環(huán)境。試驗(yàn)前12 h 禁食禁水。

1.2 試驗(yàn)儀器和藥品 高效液相色譜儀(型號(hào)為Waters 600)、熒光檢測(cè)器(型號(hào)為Waters 2475)、色譜柱Symmetry C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),購(gòu)自Waters 公司;NE(批號(hào)為097K1450)、DA(批號(hào)為087K1174),均購(gòu)自Sigma 公司;色譜級(jí)甲醇、色譜級(jí)乙腈、噻拉嗪:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院外科教研室提供。

1.3 樣品采集與處理 生理鹽水對(duì)照組:肌肉注射生理鹽水1.31 mL/kg·bw 后處死山羊后,剪開(kāi)頭皮,同時(shí)除去硬腦膜并鋸開(kāi)頭蓋骨,取出山羊腦;對(duì)于其他試驗(yàn)組:在每個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死山羊,取腦。 在冰上迅速將大腦,小腦,海馬,丘腦和腦干分離后所有樣品分別稱(chēng)重后液氮冷凍,并于-80 ℃保存。

取冰凍的腦組織,放入預(yù)冷的1 mL 玻璃組織勻漿器中,加入10 倍體積、4 ℃的提取液,上下轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)10 次,充分研磨組織使勻漿化(約3~5 min)。將勻漿液轉(zhuǎn)入EP 管中,4 ℃高速離心15 min(4 000 r/min),收集上清液。將上清液再次轉(zhuǎn)入另一EP 管中,4 ℃高速離心10 min(12 000 r/min),得上清液。取離心后所得上清液,用微孔過(guò)濾器過(guò)濾,收集過(guò)濾后的液體,得到待測(cè)樣品溶液。

1.4 主要溶液的配制 提取液:0.1 mol/L HClO4和0.2 mmol/L EDTA-2Na 的混合溶液。

標(biāo)準(zhǔn)液:分別精密稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg,置于1 000 mL 容量瓶中,用提取液溶解并稀釋至刻度,即為5 μg/mL 的溶液。再取10 mL 以上溶液用提取液稀釋10 倍,配成濃度為500 ng/mL 的儲(chǔ)備液,于4 ℃冰箱中保存待用。

流動(dòng)相:甲醇與去離子水(含40 mmol/L 醋酸鈉、30 mmol/L 檸檬酸、0.2 mmol/L EDTA-2Na、0.4 mmol/L 辛烷磺酸鈉)按照20 ∶80 的比例(v/v)配成流動(dòng)相,用1 mol/L 的NaOH 溶液準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH 值=4.2。抽濾后,超聲脫氣30 min,置于4 ℃冰箱中備用。

1.5 色譜條件 固定相Symmetry C18(4.6×150 mm,5 μm);流動(dòng)相:離子水(含40 mmol/L 醋酸鈉、30 mmol/L 檸檬酸、0.2 mmol/L EDTA-2Na、0.4 mmol/L 辛烷磺酸鈉)和甲醇(80 ∶20 v/v);流速:0.6 mL/min;檢測(cè)器:Warers 2475 熒光檢測(cè)器,熒光檢測(cè)波長(zhǎng)λEX=280 nm,λEM=330 nm。進(jìn)樣量為20 μL,采用外標(biāo)法定量分析,檢測(cè)各腦區(qū)NE 和DA 的含量。

1.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析 使用SPSS18 軟件數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)做單因素方差分析,P<0.05 為差異顯著,P<0.01 為差異極顯著。應(yīng)用GraphPad Prism 5對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 噻拉嗪對(duì)山羊不同腦區(qū)NE 含量的影響 如圖1 所示,山羊肌肉注射噻拉嗪后,麻醉組海馬、大腦和丘腦內(nèi)NE 含量均顯著降低,與對(duì)照組比較分別降低了32.27%(P<0.05)、35.48%(P<0.01)和31.71%(P<0.01);恢復(fù)Ⅰ組大腦和海馬中NE 仍受抑制外(P<0.05),丘腦中NE 含量顯著恢復(fù)(P>0.05);恢復(fù)Ⅱ組上述各腦區(qū)內(nèi)NE含量均顯著恢復(fù)(P>0.05),同時(shí)與麻醉組比較差異極顯著(P<0.01)。其他腦區(qū)內(nèi)NE 含量均無(wú)顯著變化。

2.2 噻拉嗪對(duì)山羊不同腦區(qū)DA 含量的影響 如圖2 所示,山羊肌肉注射噻拉嗪后,麻醉組大腦、海馬和丘腦內(nèi)DA 含量均顯著降低,與對(duì)照組比較分別降低了33.10%(P<0.01)、35.03%(P<0.05)和27.01%(P<0.01);恢復(fù)Ⅰ組丘腦中DA 仍受抑制外(P<0.05),海馬和大腦中DA 含量顯著恢復(fù)(P>0.05);恢復(fù)Ⅱ組上述各腦區(qū)內(nèi)DA 含量均顯著恢復(fù)(P>0.05),同時(shí)與麻醉組比較差異極顯著(P<0.01)。其他腦區(qū)內(nèi)DA 含量均無(wú)顯著變化。

3 討論

根據(jù)我們的試驗(yàn)結(jié)果,噻拉嗪作為山羊麻醉作用的機(jī)制與NE 和DA 的含量變化有關(guān)。去甲腎上腺素(NE)屬于兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì),腎上腺素能神經(jīng)末梢具有合成、儲(chǔ)存與釋放神經(jīng)遞質(zhì)NE 的功能。當(dāng)α2受體激動(dòng)劑使突觸前膜的α2受體激動(dòng),可使NE 水平降低[9]。山羊肌肉注射噻拉嗪(12.8 mg/kg·bw)后,山羊各腦區(qū)NE 含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),各腦組織NE 濃度的最低值均出現(xiàn)在麻醉組,其中大腦、海馬和丘腦含量變化顯著,這種先降低后升高的趨勢(shì)與孫緒德等[10]報(bào)道的安氟醚麻醉對(duì)犬腦中丘腦和海馬中NE 含量的影響結(jié)果相似。在大腦中NE 的含量下降最明顯,下降率為35.48%,其次是海馬和丘腦,下降率分別為32.27%和31.71%。大腦和海馬的NE 含量在恢復(fù)I 期,丘腦的NE 含量在恢復(fù)II 期均恢復(fù)至正常水平。劉秀華等[11]使用HLPC 檢測(cè)正常綿羊和注射靜松靈麻醉綿羊的血液和腦脊液中去甲腎上腺素的含量,結(jié)果表明,靜松靈對(duì)血液和腦脊液中去甲腎上腺素有明顯的抑制作用。本試驗(yàn)中NE 的變化趨勢(shì)與上述文獻(xiàn)試驗(yàn)結(jié)果一致。分析的原因可能是噻拉嗪為一種α2腎上腺能受體激動(dòng)劑,能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前膜的α2受體結(jié)合,并激動(dòng)α2受體,使突觸前膜受體Na+-K+-ATR 酶活化,Ca2+外流增加,內(nèi)流減少,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量減少,從而抑制突觸前膜去甲腎上腺素的釋放[12-13]。結(jié)果表明,噻拉嗪可降低山羊大腦、丘腦和海馬中NE 的含量。

圖1 噻拉嗪對(duì)山羊不同腦區(qū)NE 含量的影響 (n=5,ng/mL)

圖2 噻拉嗪對(duì)山羊不同腦區(qū)DA 含量的影響 (n=5,ng/mL)

多巴胺(DA)也屬于兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì),DA是合成NE 的前體,抑制DA 的釋放,會(huì)導(dǎo)致NE 的合成減少,而NE 受到抑制時(shí),DA 的含量也會(huì)相應(yīng)減少,兩者成正相關(guān)關(guān)系[14]。山羊肌肉注射噻拉嗪(12.8 mg/kg·bw)后,山羊各腦區(qū)DA 含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),各腦組織DA 濃度的最低值均出現(xiàn)在麻醉組,其中大腦、海馬和丘腦含量變化顯著,與對(duì)照組比較分別降低33.10%、35.03%和27.01%。哈達(dá)等[15]使用鹽酸噻拉嗪對(duì)正常大鼠麻醉,并對(duì)大鼠腦中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)麻醉組中的DA 含量比正常組含量低,證明鹽酸噻拉嗪可使腦內(nèi)DA 的含量降低。這一結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似。大腦和海馬DA 含量在恢復(fù)I 期,丘腦DA 含量在恢復(fù)II 期均恢復(fù)至正常水平。分析結(jié)果可能是一方面噻拉嗪抑制腦組織中NE 的釋放,對(duì)DA 的合成形成負(fù)反饋調(diào)節(jié);另一方面可能是通過(guò)激活酪氨酸羥化酶(TH)的活性,使腦組織中DA 的合成減少。結(jié)果表明,噻拉嗪可抑制大腦、海馬和丘腦中DA 的含量。其中,小腦和腦干中NE 和DA 的含量變化不顯著(P>0.05),無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)變化。噻拉嗪麻醉對(duì)NE 和DA 的影響機(jī)制主要是刺激大腦前突觸的α2-腎上腺能受體,阻斷鈣的流入,抑制腎上腺神經(jīng)突觸前末梢釋放NE,使體內(nèi)NE 的濃度降低,從而體內(nèi)DA 的含量也相應(yīng)下降,但是在我們的研究中小腦和腦干中NE 和DA 的含量變化不顯著,可能原因是噻拉嗪對(duì)小腦和腦干內(nèi)的α2-腎上腺能受體刺激小,沒(méi)能阻斷鈣的正常流入,因此腎上腺神經(jīng)突觸前末梢釋放NE 沒(méi)有被抑制,從而使NE 和DA 的含量沒(méi)有顯著的變化。說(shuō)明NE 和DA 可能不是噻拉嗪麻醉的作用部位,這一結(jié)果與于東序等[14]報(bào)道基本一致。

4 結(jié)論

總之,噻拉嗪麻醉可引起山羊大腦、海馬和丘腦內(nèi)NE 和DA 的含量降低,以至于產(chǎn)生中樞系統(tǒng)的抑制作用,這可能是噻拉嗪產(chǎn)生全麻作用的重要機(jī)理之一。