陳柳倩，路 璐，羅 璇，江 舟，魏臻武，趙文明，陳國宏，徐 琪

（揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

為更好地實(shí)施“藏糧于地、藏糧于技”戰(zhàn)略，華東地區(qū)多處稻-麥田塊采用輪作休耕制度，復(fù)種綠肥，以促進(jìn)生態(tài)環(huán)境改善和資源永續(xù)利用。箭筈豌豆（Vicia sativa L.）是野豌豆屬（Vicia）重要的綠肥之一，不僅能夠顯著提高耕地中有機(jī)質(zhì)含量，還能增加土壤微生物含量和活性，改善各項(xiàng)理化性質(zhì)，調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分庫。根據(jù)中國數(shù)字植物標(biāo)本館（http：//www.cvh.org.cn/cms/）和宋敏等［1］的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，野豌豆屬植物廣布于我國各省，其中栽培種5種，野生種36種。不同品種的箭筈豌豆生育期和農(nóng)藝性狀差異明顯，楊紅燕［2］研究發(fā)現(xiàn)，不同品種箭筈豌豆（‘蘇箭4號’‘西牧333’‘淮箭1號’）進(jìn)入花期時(shí)間不同，‘蘇箭4號’進(jìn)入花期最早。

微衛(wèi)星又稱簡單重復(fù)序列（SSRs），一般為短的重復(fù)序列（1—6 bp）組成的串聯(lián)DNA序列，是繼RFLP、RAPD等分子標(biāo)記后出現(xiàn)的第二代分子標(biāo)記技術(shù)［3］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用于植物遺傳多樣性研究中。Liu等［4］通過轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了1 071條潛在的EST-SSR標(biāo)記。國外也有學(xué)者利用SSR技術(shù)分析了窄葉野豌豆和苕子的多樣性，發(fā)現(xiàn)這2種箭筈豌豆具有較高的遺傳多樣性，多態(tài)信息含量（PIC）達(dá)到了0.5以上［5-6］。

箭筈豌豆品種眾多，遺傳多樣性也較豐富，不同品種間農(nóng)藝性狀差異較大，生產(chǎn)中普遍存在品種雜亂、利用價(jià)值難以得到充分發(fā)揮的問題。因此，加強(qiáng)箭筈豌豆品種資源研究、篩選優(yōu)良品種，是發(fā)展綠肥生產(chǎn)的基礎(chǔ)和當(dāng)務(wù)之急。本研究以生產(chǎn)中常見的7個(gè)箭筈豌豆品種為試驗(yàn)材料，比較不同品種的生育期和鮮草產(chǎn)量，并利用微衛(wèi)星標(biāo)記評價(jià)鑒定這7個(gè)品種的遺傳多樣性以及親緣關(guān)系，旨在篩選優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，為本地區(qū)發(fā)展冬季休耕綠肥生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在揚(yáng)州大學(xué)草業(yè)科學(xué)試驗(yàn)基地進(jìn)行，地處江蘇省中部，位于長江北岸、江淮平原南端，為亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候向溫帶季風(fēng)氣候的過渡區(qū)。該地區(qū)年降水量864 mm，平均氣溫15.8℃，無霜期138 d。試驗(yàn)地土壤為輕壤土，容重1.48 g/cm3，土壤有機(jī)質(zhì)14.58 g/kg，pH 8.46，全氮0.821 g/kg，速效鉀57 mg/kg，有效磷5.36 mg/kg。本研究所用材料均為該地區(qū)使用較為廣泛的箭筈豌豆品種（‘蘭箭1號’‘蘭箭2號’‘蘭箭3號’‘青箭’‘貴苕’‘連苕’和‘鎮(zhèn)江野豌豆’），均由揚(yáng)州大學(xué)草業(yè)科學(xué)魏臻武教授實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 生育期和鮮草產(chǎn)量測定

供試7個(gè)箭筈豌豆品種于2018年9月20日播種，每個(gè)品種種植2個(gè)小區(qū)，共14個(gè)小區(qū)，記錄生育進(jìn)程（出苗期、分枝期、現(xiàn)蕾期、盛花期和結(jié)莢期）。盛花期后，采用樣方取樣，樣方面積為1 m2（1 m×1 m），每個(gè)小區(qū)取3個(gè)樣方，取樣后稱鮮草質(zhì)量，并折算為公頃產(chǎn)量。

1.3 SSR分型分析

1.3.1 基因組DNA提取

每個(gè)品種隨機(jī)選取混合種子20份，取種子約200 mg，加入液氮充分研磨后將粉末轉(zhuǎn)移至裂解液中，于60℃水浴20—30 min，期間上下混勻3—5次，加入苯酚-氯仿（1∶1）抽提，去除種子中淀粉等大分子物質(zhì)，離心吸取上層水相，具體方法按照試劑盒（TIANGEN，北京）說明書進(jìn)行。NanoDrop ND-1000濃度測定儀測定DNA質(zhì)量濃度并稀釋至50 ng/μL，于4℃保存。

1.3.2 SSR引物設(shè)計(jì)及篩選

參照文獻(xiàn)［4］，選取10對具有代表性的引物（表1），由南京擎科生物科技有限公司合成。將7個(gè)箭筈豌豆品種的基因組DNA分別混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行確認(rèn)，選取擴(kuò)增片段呈多態(tài)、片段長度在100—500 bp且條帶清晰的引物加入FAM熒光標(biāo)記修飾進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 SSR引物序列Table 1 The primers of SSR in the experiment

1.3.3 SSR片段擴(kuò)增與分型

以7個(gè)箭筈豌豆品種的20個(gè)樣本DNA為模板，分別與篩選出的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，優(yōu)化后的PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性35 s，53—56℃退火35 s，72℃延伸13 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，擴(kuò)增產(chǎn)物以ABI 3730XL DNA全自動基因分析儀為平臺，以GeneScan-500為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行熒光-多重PCR檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)采用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫，利用Microsatellite-Toolkit統(tǒng)計(jì)各微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Exp Ne）、雜合度（Ho、He）和多態(tài)信息含量（PIC）；并采用UPGMA聚類方法，以遺傳距離為依據(jù)構(gòu)建分析7個(gè)箭筈豌豆品種間的遺傳關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種箭筈豌豆生育期和鮮草產(chǎn)量的比較

由圖1可以看出，除‘青箭’生育期長達(dá)229 d外，其他6個(gè)箭筈豌豆品種的生育期均為175 d左右，主要差異在現(xiàn)蕾期和盛花期。從鮮草產(chǎn)量來看（圖2），‘蘭箭1號’‘蘭箭2號’‘蘭箭3號’‘青箭’‘貴苕’均超過了250 t/hm2。

圖1 不同品種箭筈豌豆生育期的比較Fig.1 Com parison of grow th period of different Vicia sativa L.varieties

圖2 不同品種箭筈豌豆鮮草產(chǎn)量的比較Fig.2 Com parison of fresh grass yield of different Vicia sativa L.varieties

2.2 不同品種箭筈豌豆遺傳多樣性分析

不同箭筈豌豆品種熒光-多重PCR檢測結(jié)果表明，選取的擴(kuò)增片段具有多態(tài)性（圖3）。由表2可知，7個(gè)箭筈豌豆品種等位基因數(shù)均較為豐富，其中‘連苕’多達(dá)30種；‘蘭箭3號’‘鎮(zhèn)江野豌豆’與‘連苕’的PIC分別為0.427、0.377和0.313，其余4個(gè)品種呈現(xiàn)低度多態(tài)（PIC＜0.25）；‘蘭箭3號’群體雜合度也較高（He＞0.5）。

圖3 熒光-多重PCR檢測結(jié)果Fig.3 Results of fluorescent-multip lex PCR

表2 7個(gè)箭筈豌豆品種遺傳多樣性參數(shù)Table 2 Genetic diversity parameters of 7 Vicia sativa L.varieties

2.3 不同箭筈豌豆品種聚類分析

采用UPGMA聚類方法，基于品種間的遺傳距離，構(gòu)建不同品種的系統(tǒng)發(fā)生樹。如圖4所示，7個(gè)品種分為兩個(gè)類群，‘連苕’‘鎮(zhèn)江野豌豆’和‘青箭’聚為一類；‘蘭箭1號’‘蘭箭2號’‘貴苕’和‘蘭箭3號’聚為一類。

3 討論

不同綠肥作物在相同生長條件下，其生長特性、最適宜翻壓時(shí)期并不同。本試驗(yàn)研究了7個(gè)箭筈豌豆品種的生育進(jìn)程和鮮草產(chǎn)量，結(jié)果表明：在本試驗(yàn)條件下，除‘青箭’生育期較長外，其他6個(gè)箭筈豌豆品種的生育期均為175 d左右。由于‘青箭’現(xiàn)蕾期和盛花期時(shí)間較長，勢必延長種植‘青箭’適宜翻壓時(shí)期，影響下一季水稻種植，因此‘青箭’不適宜本地區(qū)推廣種植。綠肥生物量越多，翻埋后越有利于培肥地力［7］。從鮮草產(chǎn)量來看，‘蘭箭1號’‘蘭箭2號’‘蘭箭3號’‘青箭’‘貴苕’均超過了250 t/hm2。前人研究表明，春箭筈豌豆5-1-5品系苗期生長緩慢，鮮草產(chǎn)量只有114.7 t/hm2［8］，‘隴箭1號’兩年平均產(chǎn)量只有96.6 t/hm2，可見‘蘭箭3號’等幾個(gè)品種具有較高的生物量，意味著翻耕后具有較好的培肥地力。

遺傳多樣性分析表明，7個(gè)箭筈豌豆品種均檢測出較多的等位基因數(shù)。但從PIC來看，僅有‘蘭箭3號’‘連苕’與‘鎮(zhèn)江野豌豆’為中度多態(tài)的品種（0.25＜PIC＜1.00），其余4個(gè)品種呈現(xiàn)低度多態(tài)（PIC＜0.25），表明野豌豆屬不同品種的PIC存在一定差異，當(dāng)然也不排除是由于檢測引物不同所致?！m箭3號’群體He較高（＞0.5），說明該品種具有豐富的遺傳多樣性。研究還發(fā)現(xiàn)，‘蘭箭1號’‘蘭箭2號’‘蘭箭3號’和‘貴苕’聚為一類。

綜上，‘蘭箭3號’具有合適的生育期、較高的產(chǎn)量和遺傳多樣性，可作為本地區(qū)冬季休耕綠肥生產(chǎn)的理想品種。

圖4 基于遺傳距離構(gòu)建的7個(gè)箭筈豌豆品種聚類圖Fig.4 Clustering diagram of 7 Vicia sativa L.varieties based on genetic distance