周曉倫 萬建新 王衛(wèi)衛(wèi) 張偉 姚彥紅 高蕓

摘要：植物促生菌因其具有對植物生長促進及增強抗逆性等優(yōu)點，在植物-微生物聯(lián)合修復重金屬污染土壤中具有良好的應用潛力，能為環(huán)境生物修復以及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供優(yōu)良菌種資源，實現(xiàn)其更大范圍的應用。以甘肅省平?jīng)鍪形廴就寥乐蟹蛛x得到的Cr6+耐受菌株為目的菌，測定菌株的促植物生長特性（產(chǎn)IAA、溶磷、ACC脫氨酶活性），采用改良的Belimov方法篩選出1株促生特性較好的菌株，進行生理生化及16S rRNA基因序列分析鑒定。初步分離得到32株Cr6+耐受菌株，根據(jù)改良的Belimov方法篩選出1株S2菌株，通過生理生化及16S rRNA鑒定S2菌株為Exiguobacterium sp.，GenBank登錄號為MH180821。玉米幼苗生長試驗表明，與不同Cr6+濃度處理組相比，接種了S2菌株的玉米幼苗根長、莖長、葉面積都有顯著提高，平均根長分別增加95.74%、41.34%、194.12%，平均莖長分別增加32.03%、-30.13%、28.96%，平均葉面積分別增加73.94%、35.17%、26.92%，平均鮮質(zhì)量分別增加33.33%、33.62%、-20.00%，其顯著提高了玉米幼苗對Cr6+的耐受性。該研究表明，Exiguobacterium sp.S2在污染土壤中能夠更好地定殖并保護促植物生長能力的發(fā)揮，為重金屬污染土壤的植物-微生物聯(lián)合原位修復提供了良好的微生物資源。

關鍵詞：玉米幼苗;Cr6+耐受菌株;ACC脫氨酶;吲哚乙酸;微小桿菌

中圖分類號： X53;S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0273-05

在過去幾十年的工業(yè)領域中，大量的使用重金屬[鉻（Cr）、鎳、銅、鋅、鉛、隔等]導致土壤和地下水污染，對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成重大的威脅。在不同的重金屬中，鉻是主要的污染物之一，由皮革制革、電鍍、采礦、紡織、金屬加工、化肥、染料和顏料制造等各種工業(yè)應用產(chǎn)生[1]。Cr化合物對植物的毒性很大，不利于植物的新陳代謝。雖然許多植物不受低濃度Cr（3.8×10-4 μmol/L）的影響，但當Cr濃度為 100 μmol/（L·kg）時，對高等植物有毒害[2]。外部環(huán)境存在的Cr改變了植物生長發(fā)育的格局。已有研究表明根生長的減少是由于樹木和植物中的重金屬[3]。

文獻調(diào)查表明，幾乎沒有人報道植物中鉻毒性的改良方法，主要原因在于大多數(shù)研究集中于通過樹木和植物促進Cr的積累，達到植物修復的作用。Khan報道合歡樹、阿拉伯相思樹和印度黃檀這些樹種的菌根保護它們免受重金屬的毒害和制革廠廢水鉻的污染[4]。Karagiannidis等研究泡囊叢枝菌根真菌（漏斗孢球囊霉）對硬質(zhì)小麥生長和營養(yǎng)吸收的影響，證實泡囊叢枝菌根真菌（VAFM）能夠提高小麥的生物量和減少Cr在植物中的含量[5]。Davies等發(fā)現(xiàn)VAFM能夠增強向日葵耐受Cr的能力，VAFM對Cr處理植物的組織礦物濃度、生長和氣體交換都有積極的作用[6-7]。正如Burd等陳述的，在重金屬污染的土壤中重金屬含量已經(jīng)超過了植物的耐受范圍，它可能會用根際微生物處理植物以此來增加植物的生物量，穩(wěn)定和修復被污染環(huán)境中的植物[8]。

植物對重金屬的耐受與其產(chǎn)生的一種多肽類物質(zhì)有關，這種物質(zhì)能夠螯合重金屬，從而減少重金屬對植物根系酶的傷害[9]。植物根的活動可能增加金屬、非金屬的溶解性，通過酸化、氧化還原反應、分泌金屬螯合物或者有機配體與陰離子競爭結(jié)合位點[10]。微生物通過產(chǎn)生有機配體，分解土壤中的有機物質(zhì)或者分泌一些代謝物能夠改變金屬、非金屬之間的轉(zhuǎn)化[11]。土壤菌群和作物根之間相互作用對植物的發(fā)育和存活有著不可估量的作用[12]。數(shù)個植物相關細菌已被報道能夠加速重金屬污染的生物修復，通過促進植物生長，在促進植物修復中起著重要的作用[13-14]。這些植物促生菌能夠使宿主增長和重金屬積累的過程可能包括（1）合成一些化合物[例如吲哚-3-乙酸、吲哚乙酸（IAA）、鐵載體、有機酸;1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶];（2）刺激一些代謝途徑（例如生物固氮和溶磷）;（3）改變金屬在植物中的遷移率和有效性。該研究從3個不同污染地區(qū)土壤中分離出32株Cr6+耐受細菌，采用改良的Belimov方法篩選出1株植物促生顯著的菌株，通過測定菌株的促生特性（IAA含量、溶磷能力、ACC脫氨酶活性），同時測定其抗重金屬能力，并基于16S rRNA基因序列及表型分析鑒定其種屬。以期得到一批優(yōu)良的土著植物促生菌，為進一步利用微生物-植物聯(lián)合修復重金屬污染提供一批微生物資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究中使用的所有化學藥品等級均為分析純，由西安姚北生物科技有限公司提供。Cr6+的儲備溶液（1 000 mg/L）：將2.829 g重鉻酸鉀（K2Cr2O7）溶于1 L無菌蒸餾水中，進一步稀釋至工作濃度。

1.2 試驗方法

1.2.1 Cr6+耐受菌株的分離 采用梅花法收集3個不同污染地區(qū)距地表15 cm的土壤：（1）甘肅省平?jīng)鍪袕R底下村（106.894074°E、35.49297°N）;（2）甘肅省平?jīng)鍪袕R底下村（106.897003°E、35.490824°N）;（3）甘肅省平?jīng)鍪卸镤伌澹?06.783376°E、35.508361°N）。準確稱取3個不同地區(qū)土壤各10 g，分別加入盛有90 mL無菌水（含有25～35個玻璃珠）的錐形瓶中，置振蕩器上振蕩15 min，得到10-1濃度的土壤稀釋液，連續(xù)稀釋至10-11，將10-1～10-11梯度的土壤稀釋液均勻地涂布于含有100 mg/L Cr6+的LB培養(yǎng)基中，（35±2） ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。挑取形態(tài)特征不同的菌落劃線至含有100 mg/L Cr6+的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每種菌株連續(xù)純化3代以上，最終使平板上的菌落形態(tài)和鏡檢的菌體形態(tài)一致，將純化的菌落劃線至牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面，4 ℃保藏，以備后續(xù)研究。共分離出32株Cr6+耐受細菌，其中菌株S2能顯著地提高玉米幼苗對Cr6+的耐受性，因此對其進行進一步的研究。

1.2.2 S2菌株的鑒定 菌株的形態(tài)觀察及生理生化試驗參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》方法[15]進行。

1.2.3 16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 Cr6+耐受細菌送生工生物工程（上海）股份有限公司完成16S rDNA擴增及序列測定。提交菌株的16S rDNA序列到美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站，與已知的序列比對分析其同源性。利用ClustalX1.81將序列進行比對，利用MEGA 5.05分子進化遺傳分析軟件分析堿基組成、GC含量，利用Kimura2參數(shù)計算遺傳距離，采用NJ鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 S2菌株ACC脫氨酶活性和產(chǎn)IAA能力的測定 ACC脫氨酶分解ACC產(chǎn)生的α-酮丁酸用來測定ACC脫氨酶活性，參照Penrose等的方法測定α-酮丁酸含量[16]。根據(jù)Bradford方法測定菌體蛋白含量[17]。根據(jù)α-酮丁酸和蛋白質(zhì)的標準曲線確定ACC脫氨酶活性。

將S2菌株挑1環(huán)到含有20 mL微量蔗糖鹽液體（SMS）培養(yǎng)基[蔗糖1%、（NH4）2SO4 0.1%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.05%、NaCl 0.01%、酵母提取物0.05%、CaCO3 0.05%，pH值7.2]的錐形瓶中28 ℃、140 r/min培養(yǎng)96 h，液體培養(yǎng)基中加入 0.5 mg/mL 的色氨酸。取1.5 mL懸浮液到2 mL離心管中 5 000 g 離心15 min，取上清液1 mL到5 mL比色管中加入 2 mL Salkowskis溶液，振蕩混勻室溫靜置20 min，比色管中溶液會出現(xiàn)粉紅色，在530 nm檢測粉紅色物質(zhì)的吸光度[18]。1個菌株做3個重復，根據(jù)IAA的標準曲線確定菌株產(chǎn)IAA能力大小。

1.2.5 溶磷和Cr6+耐受試驗 將待測菌株S2接種于含無機磷酸鹽的Pitkovskaya瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)5 d。若細菌菌落周圍出現(xiàn)清晰的暈圈，表明細菌溶解無機磷酸鹽[19]。

將待測菌株劃線接種至LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入 100～1 800 mg/L K2Cr2O7，50為1個梯度進行菌株耐受Cr6+試驗，倒置培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌株的生長情況以此來確定生長濃度和最低致死濃度。

1.2.6 S2菌株對不同Cr6+濃度下玉米幼苗生長的影響 采用改良的Belimov等的方法確定根際細菌的植物促生根長活性[20]。接種3株菌株S2、W3、S70至6 mL LB液體培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，用無菌水懸浮菌體數(shù)為5×107 CFU/mL。1 mL細菌懸浮液或無菌水（未處理的對照組）加入到含有40 mL Hoagland半固體培養(yǎng)基[KNO3 607.00 mg、Ca（NO3）2·4H2O 945.00 mg、MgSO4·7H2O 493.00 mg、NH4 H2PO4 115.00 mg、H3BO3 2.86 mg、MnCl2·4H2O 2.13 mg、ZnSO4·7H2O 0.22 mg、CuSO4·5H2O 0.08 mg、H2MoO4·H2O 0.02 mg、FeSO4· 7H2O 5.57 mg、Na2-EDTA 7.45 mg]試管中（內(nèi)徑30 mm）[21]。處理組在半固體培養(yǎng)基中加入適當?shù)腃r6+，濃度依次為10、50、100 mg/L，對照組不加金屬離子。用3% H2O2和95%乙醇（體積比1 ∶ 1）對白菜幼苗表面滅菌 20 min，無菌水沖洗數(shù)次至種子表面無氣泡產(chǎn)生，挑選15個種子到Hoagland半固體培養(yǎng)基，所有的試驗處理組作3次重復。在光照培養(yǎng)箱中28 ℃黑暗培養(yǎng)15 d，培養(yǎng)后測量玉米幼苗的根長、莖長、葉面積、鮮質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 one-way ANOVA進行分析;多重比較采用Fishers Student-Newman-Keulsa，b。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cr6+耐受菌株S2的分離與鑒定

從污染土壤中分離得到Cr6+耐受菌株S2，G+、短桿狀，在含有Cr6+營養(yǎng)瓊脂平板上形成圓形濕潤的橙黃色菌落。由表1可知，菌株S2觸酶陽性，氧化酶陰性，能還原硝酸鹽，水解明膠、淀粉和酪素，分解葡萄糖、蔗糖、半乳糖。根據(jù)菌體形態(tài)特征和生理生化，菌株S2為Exiguobacterium spp.。為了證實這一點，菌株的分子鑒定通過16S rDNA基因測序和基因Blast比對。由圖1可知，菌株S2與Exiguobacterium sp. SH20（KU696286.1）具有密切的同源性。菌株S2的16S rDNA序列以唯一的登錄號MH180821進入GenBank。為了確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育位置，筆者使用NCBI獲得的序列及MEGA 5.10軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。

2.2 S2菌株ACC脫氨酶活性和產(chǎn)IAA能力測定

植物不斷地暴露在非生物脅迫中，例如干旱、重金屬等。引入含有ACC脫氨酶的植物促生菌到重金屬土壤中能夠緩解這種脅迫對植物生長的影響，植物促生菌能夠在這種脅迫下生存，并結(jié)合在種子的表面或者植物的根上，通過ACC脫氨酶降解乙烯的直接前體ACC來降低植物體內(nèi)乙烯的含量，從而促進植物的生長和發(fā)育[22]。植物促生菌也通過合成IAA的方式促進植物的生長，IAA直接刺激植物細胞的延生和分裂或者提高植物自身的防御系統(tǒng)[23]。Exiguobacterium sp. S2具有較高的產(chǎn)IAA能力和ACC脫氨酶活性，不溶解磷酸鹽（表2）。

2.3 Cr6+耐受菌株對不同Cr6+濃度下玉米幼苗生長的影響

玉米幼苗的根長和葉面積對Cr6+效應表明，玉米生長容易受這種金屬的影響，這種效應隨著重金屬濃度的增加會更明顯（表3）。接種3株Cr6+耐受菌株的玉米幼苗的根長、葉面積結(jié)果表明，相對于未接種Cr6+耐受菌株的對照組，接種Cr6+耐受菌株有利于植物根和葉面積的生長;不同濃度Cr6+接種S70菌株的玉米幼苗根長與對照組相比顯著減少;處于不同濃度的Cr6+時接種S2菌株有利于玉米根和葉面積的生長（表3）;在不同濃度（10、50、100 mg/L）的Cr6+存在時，接種S2菌株的玉米幼苗的平均根長分別增加95.74%、41.34%、194.12%，平均莖長分別增加32.03%、-30.13%、28.96%，平均葉面積分別增加 73.94%、35.17%、26.92%，平均鮮質(zhì)量分別增加33.33%、33.62%、-20.00%。在不同濃度的Cr6+存在時，菌株S2、S70、W3接種的玉米幼苗的平均根長、莖長、葉面積都有所增加或者減少，相比之下Cr6+對植物根長、葉面積影響比較大，對莖長、鮮質(zhì)量的影響比較小，隨著濃度的增加這種響應越明顯，再次證明Cr6+對白菜生長的影響比較嚴重（表3）。

在該研究中S2菌株經(jīng)過測定，既含有ACC脫氨酶又能產(chǎn)生吲哚乙酸，不溶解磷酸鹽。根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rRNA初步鑒定為Exiguobacterium sp. S2。具有ACC脫氨酶活性的菌株通過減少乙烯含量幫助植物抵抗逆境脅迫，是因為ACC脫氨酶水解ACC為α-酮丁酸和氨[24]。試驗中不同濃度的Cr6+（10、50、100 mg/L）對玉米幼苗的生長有毒害作用，但是當接種Cr6+耐受菌株Exiguobacterium sp. S2后，玉米幼苗的根長、葉面積明顯大于對照組。當Cr6+濃度為100 mg/L時，接種S2、S70、W3菌株都有利于玉米幼苗根長和葉面積的生長，說明3株Cr6+耐受菌株之間有顯著的差異性。

3 結(jié)論與討論

在重金屬環(huán)境中一些植物促生菌能夠顯著促進植物生長[11]。植物促生菌作為植物種子菌劑，應用到含有重金屬的土壤中，已經(jīng)證明能夠根本性地減少重金屬對植物的毒害，同時提高植物的總體增長和產(chǎn)量收益[25]。Bharti等研究了2種耐鹽PGPR，Bacillus pumilus STR2和深海細菌（Exiguobacterium oxidotolerans） STR36，其中從鹽堿土植物根際分離到的E. oxidotolerans STR 36菌株能夠分泌豐富的胞外多糖，緩解高鹽對植物體的脅迫，在原生鹽堿土、次生鹽堿土中接種Exiguobacterium oxidotolerans STR36的婆羅米植株生物量比未接菌分別高出109%、138%;植物體中活性物質(zhì)三萜皂苷假馬齒莧皂苷A（bacoside-A）含量比未接菌植株分別高出36%、76%[26]。本研究中接種菌株S2的玉米幼苗生物量與對照組相比分別增加33.33%、33.62%、-20.00%，也證實了這一點。Dastager等從印度喀拉拉邦省的西加特森林土壤中分離得到1株植物促生菌Exiguobacterium NⅡ-0906，NⅡ-0906菌株于30 ℃能溶磷 84.7 μg/（mL·d），合成嗜鐵素，分泌氫氰酸（HCN），可對常見的植物致病真菌產(chǎn)生拮抗作用，接種了NⅡ-0906菌株的植物根、莖和生物量均有顯著增加[27]。乙酰短桿菌（Exiguobacterium acetylicum） 1 P（MTCC 8707）是1株從蘋果果園根際土壤分離得到的細菌，MTCC 8707于15 ℃能溶磷（21.1±1.18） μg/（mL·d），合成嗜鐵素，分泌HCN，可對常見的植物致病真菌產(chǎn)生頡頏作用，MTCC8070具有分泌IAA的能力[28]。這2種E. spp.（Exiguobacterium NⅡ-0906、Exiguobacterium acetylicum 1P）不僅可以提高生物質(zhì)產(chǎn)量，并且能夠增強植物的抗逆性。

在重金屬Cr6+脅迫下，接種Exiguobacterium sp. S2玉米幼苗的各種生理指標表明，在不同濃度Cr6+存在時都能促進植物總體的增長;這項工作證明了存在重金屬Cr6+時引入微小桿菌能確保植物的生存，甚至保護它們;植物效應與重金屬濃度、污染物的接觸時間、植物固有的抗性有關。當存在微小桿菌時，能夠維持玉米幼苗根長、葉面積、莖長的生長，對重金屬的耐受性試驗表明這種植物與微小桿菌之間有協(xié)同作用，特別是Exiguobacterium sp. S2對污染物影響的回應。微小桿菌就像分析的那樣，可以推薦用來增加植物的生物量，穩(wěn)定或修復重金屬污染的土壤。Exiguobacterium spp.分布廣泛，生存環(huán)境多樣，具有分解復雜有機污染物、轉(zhuǎn)化重金屬、促生作用等極具實用價值的功能。

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