司振書(shū) 殷國(guó)政 路建彪

摘要：為H9N2亞型AIV進(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒定與診斷，根據(jù)H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA基因各設(shè)計(jì)1對(duì)引物，建立了一種對(duì)2個(gè)表面基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增的雙重RT-PCR檢測(cè)方法。HA、NA基因預(yù)期擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度分別為700、423 bp。通過(guò)對(duì)H9N2亞型禽流感病毒不同稀釋度的尿囊液進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25 EID50/100 μL。采用該方法對(duì)H1～H15和N1～N9等亞型流感病毒及新城疫病毒等進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果只有H9N2亞型AIV出現(xiàn)2個(gè)特異性目的條帶，與其他常見(jiàn)禽病病原無(wú)交叉反應(yīng);用建立的雙重RT-PCR和病毒分離2種方法同時(shí)對(duì)送檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果2種方法的符合率達(dá)99.77%，說(shuō)明該檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、敏感性較高，在臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查方面具有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：禽流感病毒;H9N2亞型;雙重RT-PCR;檢測(cè)方法

中圖分類號(hào)： S852.65+7 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）07-0035-03

H9N2亞型禽流感病毒為中低致病力毒株，分布廣泛，司振書(shū)等對(duì)山東省雞群進(jìn)行了H9亞型AIV的感染情況進(jìn)行了調(diào)查，疑似流感病雞病料RT-PCR陽(yáng)性率為8.41%[1]。該病毒能造成雞群的免疫抑制，如果與其他病原協(xié)同感染則可引起禽類嚴(yán)重發(fā)病，如與金黃色葡萄球菌混合感染可引起肉雞發(fā)病，死亡率達(dá)6%[2]。2013年，我國(guó)發(fā)生了H7N9感染人事件，6個(gè)內(nèi)部基因全部來(lái)自于H9N2 AIV[3-4]，1999年來(lái)發(fā)生了多次H9N2亞型AIV感染人的事件[5]，給人類健康帶來(lái)威脅。禽流感病毒有多種檢測(cè)方法，包括血凝（HA）、血凝抑制（HI）試驗(yàn)，神經(jīng)氨酸酶抑制（NI）試驗(yàn)，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），病毒的中和試驗(yàn)（NT），免疫熒光抗體技術(shù)（IFA）和real-time RT-PCR等。司振書(shū)等建立了針對(duì)H9亞型AIV的RT-PCR檢測(cè)方法[6]，包紅梅等建立了一步法RT-PCR檢測(cè)方法，具有較好地特異性和敏感性[7]，但以上方法沒(méi)有對(duì)NA基因進(jìn)行擴(kuò)增，不能確定NA亞型。司振書(shū)等對(duì)H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA基因分別進(jìn)行擴(kuò)增，操作較麻煩且多耗試驗(yàn)材料[8]。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法則需要多種亞型的血清和抗原，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。根據(jù)H9N2亞型禽流感病毒的HA基因和NA基因各設(shè)計(jì)1對(duì)引物，初步建立了一種針對(duì)H9N2亞型AIV的雙重RT-PCR檢測(cè)方法，該方法特異性強(qiáng)、敏感性較高。該試驗(yàn)于2012年在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物流感研究室完成。

1 材料與方法

1.1 毒株

H9N2亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)參考毒株、H1～H15亞型AIV、N1-N9 亞型AIV、雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、馬立克氏病病毒及雞痘病毒等毒株，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物流感研究室保存并提供。

1.2 引物的設(shè)計(jì)、合成與篩選

針對(duì)HA、NA基因的保守區(qū)序列分別設(shè)計(jì)特異性引物，用Oligo 4.0軟件分析上下游引物是否匹配，將分析合格的引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司北京合成部合成。分別合成了針對(duì)HA、NA基因的5對(duì)引物，用H9N2亞型AIV進(jìn)行篩選，根據(jù)擴(kuò)增效率確定的引物對(duì)見(jiàn)表1。HA、NA基因擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度分別為700、423 bp。

1.3 主要試劑

TRIzol Reagent，由Invitrogen公司生產(chǎn);反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622，F(xiàn)ermentas;三氯甲烷、異丙醇、乙醇等均為市售;T4連接酶，由Promega公司生產(chǎn);GoldenView、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，由北京索萊寶公司生產(chǎn);Trans5K DNA Marker、DL2000DNA Marker、DH5α感受態(tài)細(xì)胞，由北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);PMD-18T載體，由TaKaRa公司生產(chǎn)。

1.4 H9N2亞型AIV病毒含量的測(cè)定

取感染H9N2亞型禽流感病毒A/雞/山東/ZB/2007的尿囊液，作10倍倍比稀釋，每個(gè)稀釋度接種3枚雞胚，0.1 mL/枚。35 ℃孵育48 h，將雞胚于4 ℃過(guò)夜，收獲尿囊液，測(cè)定其血凝效價(jià)，按Reed-Muench法公式計(jì)算半數(shù)感染量。

1.5 病毒RNA的提取

Trizol法提取毒株A/Chicken/Shandong/ZB/2007和A/Chicken/Shandong/6/96的RNA，立即作RT-PCR的擴(kuò)增或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 cDNA的合成

按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 雙重RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

對(duì)雙重RT-PCR的反應(yīng)體系和變性、退火、延伸溫度和時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。最后確定采用總體積為25 μL的反應(yīng)體系：2×PCR mix buffer12.5 μL;濃度為 20 pmol/μL HA上游引物H9-F 1.0 μL;HA下游引物H9-R 1.0 μL;濃度為20 pmol/μL NA上游引物N2-F 1.5 μL;NA下游引物N2-R 1.5 μL;ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。最后確定雙重RT-PCR最佳循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，48 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.8 雙重RT-PCR特異性試驗(yàn)

用建立的雙重RT-PCR方法分別對(duì)H1～H15亞型AIV、N1-N9亞型AIV進(jìn)行檢測(cè)，以檢測(cè)其他亞型病毒是否存在假陽(yáng)性，即是否與其他亞型AIV具有交叉反應(yīng);用該方法對(duì)雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、馬立克氏病病毒及雞痘病毒等毒株進(jìn)行檢測(cè)，分析該雙重RT-PCR檢測(cè)方法的特異性。

1.9 雙重RT-PCR敏感性試驗(yàn)

對(duì)已確定病毒含量的毒株A/Chicken/Shandong/ZB/2007的尿囊液進(jìn)行100、10-1、10-2、10-3、10-4等不同稀釋度稀釋，對(duì)不同稀釋度尿囊液進(jìn)行檢測(cè)以確定其敏感性。

1.10 雙重RT-PCR的應(yīng)用

對(duì)送檢的226份具呼吸道癥狀的病雞病料和201份棉拭子樣品用雙重RT-PCR和病毒分離2種方法檢測(cè)，以檢測(cè)2種方法的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒含量的測(cè)定結(jié)果

經(jīng)測(cè)定H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/ZB/2007的尿囊液，病毒含量為1×107.25 EID50/100 μL。

2.2 H9、N2雙重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

H9N2亞型AIV A/Chicken/Shandong/ZB/2007和A/Chicken/Shandong/6/96的雙重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1，均獲得700、423 bp的目的片段。

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)H1～H15亞型AIV（其中H9 AIV為H9N2亞型）進(jìn)行雙重RT-PCR檢測(cè)，H9N2亞型AIV擴(kuò)增出700、423 bp的2個(gè)目的條帶，其他亞型病毒均沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶（圖2）。對(duì)N1～N9等其他亞型（其中N2 AIV為H9N2亞型）AIV進(jìn)行檢測(cè)，H9N2亞型AIV擴(kuò)增出700、423 bp的目的條帶，其他亞型病毒均未出現(xiàn)條帶（圖3）。對(duì)NDV、IBV等其他病毒進(jìn)行檢測(cè)（圖4）。H9N2亞型AIV擴(kuò)增出700、423 bp的2個(gè)目的條帶，而NDV、IBV等均無(wú)條帶產(chǎn)生。結(jié)果表明，所建立的雙重RT-PCR檢測(cè)方法具有很強(qiáng)的特異性，可以特異性地檢出H9N2亞型禽流感病毒。

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)不同稀釋度的病毒液分別進(jìn)行檢測(cè)（圖5）。在10-3稀釋時(shí)，仍然可以擴(kuò)增出2個(gè)明顯的目的條帶，說(shuō)明該方法對(duì)病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25 EID50/100 μL，靈敏度較高、敏感性較強(qiáng)。

2.5 雙重RT-PCR的應(yīng)用

用建立的雙重RT-PCR和病毒分離與血清學(xué)鑒定2種方法，同時(shí)對(duì)送檢的226份具呼吸道癥狀的病雞病料和201份棉拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果2種檢測(cè)方法的符合率達(dá) 99.77%（表1）。

3 討論

H9N2亞型AIV在我國(guó)雞群中分布廣泛，并能引起人類感染，給養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生造成重大影響，因此對(duì)其快速準(zhǔn)確地鑒定非常重要。RT-PCR診斷技術(shù)可從基因水平檢測(cè)AIV，具有較高的特異性和敏感性。建立的雙重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)H1～H15、N1～N9等亞型流感病毒，新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒等進(jìn)行檢測(cè)，只有H9N2亞型AIV出現(xiàn)2個(gè)特異性目的條帶，其他亞型AIV與NDV等無(wú)任何條帶，說(shuō)明該方法對(duì)其他亞型AIV及NDV等無(wú)交叉反應(yīng)，具有特異性;通過(guò)對(duì)不同稀釋度的H9N2亞型AIV進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25 EID50/100 μL，說(shuō)明該檢測(cè)方法敏感性較高;對(duì)送檢的226份具呼吸道癥狀的病雞病料和201份棉拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果與經(jīng)典的病毒分離與血清學(xué)鑒定符合率達(dá)99.77%。

該方法H9、N2基因擴(kuò)增所產(chǎn)生的目的條帶分別為700、423 bp，相比而言，700 bp的條帶更亮，而長(zhǎng)度為423 bp的條帶較暗，盡管對(duì)各引物濃度、模板用量、退火溫度等因素進(jìn)行了多次試驗(yàn)，反復(fù)優(yōu)化，擴(kuò)增片段仍然一明一暗，短的片段雖相比暗些，但條帶明顯，不影響結(jié)果的判斷。建立的雙重 RT-PCR 方法可對(duì)H9N2亞型AIV進(jìn)行快速鑒定，該方法的建立為進(jìn)一步進(jìn)行試劑盒的研制打下了良好的基礎(chǔ)，在臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查方面具有較好的應(yīng)用前景。

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