童越，傅龍龍，安琪，賈艷飛，張開(kāi)舒，趙海豹，周芳，郭穎，盧文紅，梁小薇，唐文豪，谷翊群*

(1. 國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所男性臨床研究室/國(guó)家衛(wèi)生健康委男性生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/北京人類精子庫(kù)，北京 100081；2. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；3. 蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，蘭州 730000；4. 青島大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心，青島 266000；5. 北京大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科，北京 100191)

在生殖醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐中，添加甘油-卵黃-檸檬酸鹽冷凍保護(hù)劑、采用程控或手工慢速冷凍的精子凍存技術(shù)是男性生育力保存的首選方法[1]。對(duì)于需要接受生殖腺毒性治療的青春期前男性患者，由于睪丸內(nèi)尚無(wú)成熟精子，凍存睪丸組織或生精干細(xì)胞成為他們保留生育機(jī)會(huì)的唯一選擇[2]。國(guó)外已有多家醫(yī)療機(jī)構(gòu)為青春期前的男性患者凍存了睪丸組織，以備未來(lái)利用輔助生殖技術(shù)(ART)幫助患者生育自己的遺傳學(xué)后代[3-4]。

睪丸組織冷凍技術(shù)主要有慢速冷凍和玻璃化冷凍兩大類。目前臨床上在卵母細(xì)胞凍存實(shí)踐中，玻璃化技術(shù)已經(jīng)逐步取代慢速冷凍技術(shù)[5]。對(duì)于睪丸組織凍存，玻璃化和慢速冷凍兩種方法何者效果更好還存在爭(zhēng)議[6-8]，但由于玻璃化技術(shù)使用便利、成本低，因此更利于臨床推廣。二甲基亞砜(DMSO)和乙二醇(EG)是睪丸組織玻璃化凍存最常使用的冷凍保護(hù)劑成分，然而不同濃度的DMSO和EG對(duì)玻璃化凍存的大鼠睪丸組織的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能有何影響還不完全清楚。

本研究選擇兩周齡大鼠來(lái)模擬人在青春期前無(wú)精子產(chǎn)生的未成熟發(fā)育狀態(tài)，使用不同濃度的凍存液對(duì)大鼠睪丸組織進(jìn)行玻璃化冷凍，以探討未成熟大鼠睪丸組織玻璃化凍存的適宜濃度方案。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：兩周齡的SD雄性大鼠購(gòu)自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[證號(hào)：SCXK(京)2014-0004]，體重為(43.0±5.6)g。飼養(yǎng)溫度為(22±2)℃，相對(duì)濕度(55±5)%，光照黑暗時(shí)間比為14 h/10 h。本研究經(jīng)國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

2.主要實(shí)驗(yàn)儀器：激光共聚焦顯微鏡(Zeiss，美國(guó))、生物組織包埋機(jī)(Leica，德國(guó))、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(Leica，德國(guó))、電熱恒溫水浴箱(上海智誠(chéng))。

3.主要實(shí)驗(yàn)試劑：DMSO、EG、蔗糖等購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物公司；TUNEL熒光試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；1 μl塑料細(xì)菌接種環(huán)購(gòu)自美國(guó)Biologix公司；兔抗大鼠SOX9單克隆抗體、兔抗大鼠StAR多克隆抗體、小鼠抗大鼠UCHL1多克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，兔抗大鼠PCNA單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.睪丸組織取材：大鼠麻醉后脫頸處死，下腹部切口取出兩側(cè)睪丸，于PBS緩沖液漂洗2次，去除白膜后移入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，4℃靜置，待一次實(shí)驗(yàn)中所有睪丸取出后，將每個(gè)睪丸分割為大小約為8 mm3～9 mm3的組織塊。分到對(duì)照組的組織塊立即進(jìn)行固定，凍存組進(jìn)入冷凍流程。

2.玻璃化冷凍和復(fù)蘇：參考Curaba等[9]的研究，設(shè)計(jì)3個(gè)不同濃度冷凍保護(hù)劑的玻璃化凍存組和1個(gè)對(duì)照組。對(duì)照組的睪丸組織不作冷凍處理，直接進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3種不同濃度的玻璃化凍存液配方如下：玻璃化A組(A組)凍存液為含7.5%DMSO、7.5%EG、0.5 mol/L蔗糖和10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基；玻璃化B組(B組)為含15%DMSO、15%EG、0.5 mol/L蔗糖和10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基；玻璃化C組(C組)為含25%DMSO、25%EG、0.5 mol/L蔗糖和10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。各組平衡液的DMSO和EG濃度是對(duì)應(yīng)凍存液濃度的50%，F(xiàn)BS體積分?jǐn)?shù)不變，不添加蔗糖。各組凍存樣本復(fù)蘇時(shí)使用相同的復(fù)蘇液。復(fù)蘇液1(WS1)：含1.0 mol/L蔗糖、10%FBS的PBS；復(fù)蘇液2(WS2)：含0.5 mol/L蔗糖、10%FBS的PBS；復(fù)蘇液3(WS3)：含0.25 mol/L蔗糖、10%FBS的PBS。將分割好的睪丸組織置于平衡液中4℃孵育20 min，然后轉(zhuǎn)入凍存液(VS)中4℃孵育25 min。取出組織在紗布上稍拭干，穩(wěn)妥放置在截好的1 μl接種環(huán)上，空氣中停留5 s后直接浸入液氮中。在液氮液面下，用鑷子將載有組織的小環(huán)夾入預(yù)冷的凍存管中，封口，移入液氮罐。樣本在液氮中保存2周后進(jìn)行復(fù)蘇。

玻璃化樣本的復(fù)蘇采用快速?gòu)?fù)溫方式：自液氮中取出凍存管，立即置于37℃水浴，快速夾出睪丸組織置于37℃的WS1中停留約1.5 min，使組織從小環(huán)上脫落至溶液中并充分浸潤(rùn)。接著將組織依次在37℃的WS2、WS3中各靜置5 min，再用含10%FBS的PBS漂洗2次。

3.睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察：新鮮或凍融后的睪丸組織在Bouin’s液中固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋切片，H&E染色后封片，鏡下觀察。一次實(shí)驗(yàn)中每組隨機(jī)選取5塊組織，每塊組織分析3個(gè)切面，共進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。參考Milazzo等[10]研究中提供的半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，從生精小管內(nèi)細(xì)胞形態(tài)和生精上皮與基底膜完整性兩方面對(duì)凍融后睪丸組織形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行評(píng)分，每個(gè)切面評(píng)分之和介于0～10分。

4.免疫熒光染色：選擇相應(yīng)抗體對(duì)組織石蠟切片中精原細(xì)胞標(biāo)志物UCHL1、支持細(xì)胞標(biāo)志物SOX9、睪丸間質(zhì)Leydig細(xì)胞標(biāo)志物StAR和細(xì)胞增殖核抗原PCNA進(jìn)行免疫熒光染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸鈉緩沖液(0.01 mol/L，pH=6.0)加熱修復(fù)抗原。封閉、PBST清洗后，用稀釋的上述蛋白一抗4℃孵育過(guò)夜。次日取出后清洗，CY3標(biāo)記的熒光二抗室溫下避光孵育1 h，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。熒光顯微鏡下觀察拍照。

每次實(shí)驗(yàn)中，各組對(duì)每個(gè)指標(biāo)分析5張切片。對(duì)于UCHL1、SOX9和PCNA，每張切片在隨機(jī)選取的5個(gè)視野中共計(jì)數(shù)25個(gè)生精小管橫截面中陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)，取平均值作為單位小管中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；對(duì)于StAR，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)所有StAR陽(yáng)性Leydig細(xì)胞簇(LC)的數(shù)目，除以視野中所有生精小管總數(shù)得到單位小管對(duì)應(yīng)的Leydig細(xì)胞簇的數(shù)量。

5.原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)：用羅氏的TUNEL熒光顯色試劑盒對(duì)睪丸組織中凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，蛋白酶K處理15 min，清洗后加50 μl的TUNEL反應(yīng)工作液，避光37℃孵育1 h，清洗，DAPI復(fù)染，水性封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)TUNEL反應(yīng)陽(yáng)性的細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野(×200)，共計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/500×100%。每組分析5張切片，共進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)結(jié)果

1. 各組睪丸組織的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)：未冷凍的睪丸組織切片(對(duì)照組)可見(jiàn)生精小管排列緊密，管周間隙較小。小管內(nèi)的精原細(xì)胞和支持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可辨，排列整齊。睪丸間質(zhì)中可見(jiàn)成簇分布的完整Leydig細(xì)胞群，小淋巴管和小血管結(jié)構(gòu)完整(圖1)。

玻璃化凍融后的睪丸組織與對(duì)照組相比，形態(tài)結(jié)構(gòu)有不同程度的改變(圖1)。A組凍融后的組織形態(tài)學(xué)改變最為明顯：生精上皮由于收縮和基底膜明顯分離，出現(xiàn)較大間隙。精原細(xì)胞和支持細(xì)胞形態(tài)尚可辨認(rèn)，排列稍有紊亂，生精上皮的部分區(qū)域可見(jiàn)細(xì)胞脫落。睪丸間質(zhì)改變相對(duì)較小，可見(jiàn)零散分布的Leydig細(xì)胞。B組的形態(tài)改變相對(duì)較小，生精上皮未從基底膜脫離。精原細(xì)胞和支持細(xì)胞排列整齊，較為緊密，細(xì)胞形態(tài)清晰可辨。生精小管管周沒(méi)有出現(xiàn)膠原增厚和纖維化現(xiàn)象。小管之間的間隙較對(duì)照組稍增寬。C組睪丸組織的生精上皮輕度收縮，生精上皮與基底膜偶見(jiàn)分離。精原細(xì)胞和支持細(xì)胞的形態(tài)區(qū)分比較困難，細(xì)胞排列稍紊亂。部分小管的生精上皮出現(xiàn)空泡，可見(jiàn)生精細(xì)胞脫落以及核固縮等病理改變。睪丸間質(zhì)中小淋巴管和血管結(jié)構(gòu)大量消失，完整的Leydig細(xì)胞簇較少。

Ctrl：對(duì)照組；A：A組(7.5%DMSO+7.5%EG)；B：B組(15%DMSO+15%EG)；C：C組(25%DMSO+25%EG)圖1 不同濃度冷凍保護(hù)劑玻璃化凍存睪丸組織的形態(tài)學(xué)比較(HE染色，×400)

2. 各組睪丸組織形態(tài)學(xué)改變的半定量評(píng)分比較：各組的半定量評(píng)分結(jié)果如圖2所示，凍存組A、B、C評(píng)分均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。三組間，B組形態(tài)改變的評(píng)分最低，A組評(píng)分顯著高于B組和C組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與A組比較，#P<0.05圖2 各組睪丸組織形態(tài)學(xué)改變半定量評(píng)分結(jié)果比較

二、大鼠睪丸組織中細(xì)胞特異性標(biāo)志物及細(xì)胞增殖標(biāo)志物表達(dá)的結(jié)果

1. 精原細(xì)胞標(biāo)志物UCHL1熒光信號(hào)分布及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較：UCHL1熒光信號(hào)主要分布在生精上皮基底室靠近基膜的精原細(xì)胞核中(圖3)。與未冷凍的對(duì)照組相比，玻璃化各組UCHL1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均有所下降，A、C組UCHL1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)；冷凍組之間比較，B組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多，與C組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖7)。

2.支持細(xì)胞標(biāo)志物SOX9熒光信號(hào)分布及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較：SOX9主要分布在生精上皮中精原細(xì)胞之間或偏內(nèi)側(cè)，呈環(huán)形分布(圖4)。與對(duì)照組相比，A、C組的SOX9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著下降(P<0.05)，而B(niǎo)組與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；凍存組之間比較，B組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較A、C組顯著增多(P<0.05)(圖7)。

3. 睪丸間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物StAR熒光信號(hào)分布及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較：StAR陽(yáng)性染色主要定位在睪丸間質(zhì)中的Leydig細(xì)胞內(nèi)(圖5)。凍融后的睪丸間質(zhì)中StAR表達(dá)減少，A、B、C組與對(duì)照組之間有顯著性差異(P<0.05)(圖7)。3個(gè)凍融組之間，B組熒光信號(hào)數(shù)量最多，而C組完整的LC簇?cái)?shù)量最少(P<0.05)。

4.細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA熒光信號(hào)分布及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較：PCNA主要分布在精原細(xì)胞等DNA復(fù)制較為活躍的細(xì)胞中，由于2周齡大鼠的睪丸發(fā)育尚未成熟，也有部分支持細(xì)胞處于有絲分裂階段，因此也有PCNA表達(dá)(圖6)。B組與對(duì)照組PCNA的表達(dá)量最為接近，二者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；A組和C組的熒光信號(hào)較對(duì)照組下降顯著(P<0.05)，但A、C組之間差異不大(P>0.05)(圖7)。

Ctrl：對(duì)照組；A：A組(7.5%DMSO+7.5%EG)；B：B組(15%DMSO+15%EG)；C：C組(25%DMSO+25%EG)圖3 各組睪丸組織中UCHL1的表達(dá)(免疫熒光，×200)

Ctrl：對(duì)照組；A：A組(7.5%DMSO+7.5%EG)；B：B組(15%DMSO+15%EG)；C：C組(25%DMSO+25%EG)圖4 各組睪丸組織中SOX9的表達(dá)(免疫熒光，×200)

Ctrl：對(duì)照組；A：A組(7.5%DMSO+7.5%EG)；B：B組(15%DMSO+15%EG)；C：C組(25%DMSO+25%EG)圖5 各組睪丸組織中StAR的表達(dá)(免疫熒光，×200)

Ctrl：對(duì)照組；A：A組(7.5%DMSO+7.5%EG)；B：B組(15%DMSO+15%EG)；C：C組(25%DMSO+25%EG)圖6 各組睪丸組織中PCNA的表達(dá)(免疫熒光×200)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05圖7 各組睪丸組織中細(xì)胞標(biāo)志物免疫熒光顯色統(tǒng)計(jì)結(jié)果

三、睪丸組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

未冷凍對(duì)照組的凋亡指數(shù)為(0.35±0.1)%，冷凍后睪丸組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，A、B、C組的凋亡指數(shù)分別為(1.9±0.6)%、(1.2±0.2)%、(3.9±1.0)%，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；3個(gè)冷凍組之間，B組凋亡指數(shù)最低，顯著低于A、C組(P<0.05)(圖8)。

Ctrl：對(duì)照組；A：A組(7.5%DMSO+7.5%EG)；B：B組(15%DMSO+15%EG)；C：C組(25%DMSO+25%EG)圖8 各組睪丸組織TUNEL檢測(cè)結(jié)果

討 論

目前，臨床上對(duì)于包括睪丸組織凍存在內(nèi)的新型生育力保存手段的需求越來(lái)越大[11]。對(duì)于罹患腫瘤、免疫性疾病等需要進(jìn)行性腺毒性治療的患者，通過(guò)睪丸組織凍存幫助患者保留生育機(jī)會(huì)對(duì)提高患者家庭生活質(zhì)量具有重要意義。

盡管睪丸組織凍存的相關(guān)研究已有一定時(shí)間，但無(wú)論是實(shí)驗(yàn)室還是臨床上都尚無(wú)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)程序。未成熟大鼠睪丸組織的玻璃化凍存效果在不同的實(shí)驗(yàn)室有一定的差異。適宜濃度的冷凍保護(hù)劑是溶液玻璃化狀態(tài)形成的關(guān)鍵因素之一[12]，保護(hù)劑濃度過(guò)低無(wú)法提供足夠的保護(hù)效果，在降溫和升溫過(guò)程中會(huì)由于冰晶形成、氧化應(yīng)激等理化因素造成細(xì)胞損傷。而當(dāng)保護(hù)劑濃度過(guò)高時(shí)，不僅會(huì)由于滲透損傷效應(yīng)破壞細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞器，其化學(xué)毒性作用還會(huì)破壞細(xì)胞核DNA完整性、干擾生物合成和代謝，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降甚至凋亡[13]。

為了保證冷凍效率的同時(shí)降低單一成分滲透性保護(hù)劑濃度過(guò)高引起的毒性反應(yīng)，一般選擇兩種及以上保護(hù)劑成分混合使用。DMSO作為滲透性冷凍保護(hù)劑單獨(dú)使用時(shí)，比EG、異丙醇、甘油等其他保護(hù)劑在冷凍過(guò)程中更能有效地保護(hù)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞活力[10]，但同時(shí)，過(guò)高濃度的DMSO會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)蛋白變性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。EG分子量小，容易穿透細(xì)胞膜。由于其毒性較低，即使在濃度較高時(shí)細(xì)胞仍然可以耐受，因而在玻璃化冷凍中被廣泛應(yīng)用[15]。已有較多證據(jù)支持采用DMSO和EG的組合對(duì)睪丸組織進(jìn)行冷凍可以獲得較為滿意的凍存效果[16]，但該組合在玻璃化凍存中的適宜濃度還缺乏詳細(xì)的論證。

本研究參考既往人和小鼠未成熟睪丸組織玻璃化凍存的相關(guān)研究[17-18]，將使用較多的15%(DMSO/EG)作為中間濃度，低濃度組和高濃度組分別設(shè)置為7.5%(DMSO/EG)和25%(DMSO/EG)，分析不同濃度保護(hù)劑處理的組織凍存后在結(jié)構(gòu)和功能表型等方面的差異。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示15%(DMSO/EG)組結(jié)構(gòu)保存較好，而7.5%(DMSO/EG)組的生精小管結(jié)構(gòu)有明顯損傷。滲透性冷凍保護(hù)劑充分置換胞內(nèi)水分是實(shí)現(xiàn)快速降溫時(shí)玻璃化狀態(tài)的形成的必要條件，A組溶液中保護(hù)劑濃度較低，可能對(duì)水分的置換不充分，導(dǎo)致溶液在降溫過(guò)程中不能完全玻璃化或在復(fù)溫過(guò)程中出現(xiàn)再結(jié)晶。胞內(nèi)產(chǎn)生的冰晶會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，降低細(xì)胞活性和功能；胞外產(chǎn)生的冰晶則會(huì)破壞組織層次間的粘附和連接，引起生精細(xì)胞脫落、上皮與基底膜間空隙形成[17，19]。

UCHL1是泛素羧基端水解酶家族成員，在發(fā)育時(shí)期睪丸中的精原細(xì)胞內(nèi)特異性高表達(dá)，敲除UCHL1的小鼠精原細(xì)胞無(wú)法正常發(fā)育。SOX9是性別決定相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在睪丸中主要在支持細(xì)胞中表達(dá)，調(diào)控支持細(xì)胞分化，與垂體-性腺軸的功能維持密切相關(guān)。StAR是膽固醇在線粒體中轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因子，在睪丸中主要分布在Leydig細(xì)胞中，StAR正常表達(dá)對(duì)睪丸內(nèi)分泌功能有重要意義。增殖細(xì)胞核抗原PCNA是真核細(xì)胞有絲分裂時(shí)復(fù)制復(fù)合體的核心成分，對(duì)DNA的復(fù)制和損傷修復(fù)起關(guān)鍵作用，可作為評(píng)價(jià)冷凍后細(xì)胞增殖潛力的標(biāo)志物[20]。本研究的結(jié)果顯示玻璃化凍存組中B組的PCNA表達(dá)水平最高，可能意味著該濃度保護(hù)劑對(duì)凍融睪丸組織中精原及幼稚支持細(xì)胞的增殖能力維持較為有利。既往研究表明，較高濃度的冷凍保護(hù)劑更容易形成良好的玻璃化狀態(tài)[21]。本研究中，B組的細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)和細(xì)胞增殖能力在3組中最高，提示15%(DMSO/ EG)保護(hù)劑可以在凍融過(guò)程中相對(duì)較好地維持細(xì)胞的生理功能。高濃度C組的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變比低濃度A組小，但細(xì)胞標(biāo)志物和功能指標(biāo)的變化趨勢(shì)卻與之相反，且凋亡比例在3組中最高，我們推測(cè)這是由于C組25%(DMSO/EG)冷凍保護(hù)劑濃度過(guò)高，其化學(xué)毒性超出了細(xì)胞的承受范圍，在平衡過(guò)程中造成細(xì)胞內(nèi)蛋白變性失活以及部分細(xì)胞凋亡。

本研究的濃度分組數(shù)量有限，組間濃度差梯度較大，未來(lái)可以嘗試進(jìn)一步縮小組間濃度差，以探索更適合未成熟睪丸組織的冷凍保護(hù)劑濃度方案。DMSO對(duì)大鼠精原細(xì)胞冷凍保存較為有利，而EG對(duì)精母細(xì)胞保存更為有利，并且未成熟和成熟睪丸組織對(duì)保護(hù)劑的耐受性可能存在差異[15]。因此，建議根據(jù)凍存目的和實(shí)驗(yàn)對(duì)象的發(fā)育階段對(duì)凍存液中各組分的濃度進(jìn)行調(diào)整，以提高對(duì)特定組織的保存效率。

綜上，我們認(rèn)為冷凍保護(hù)劑的不同濃度對(duì)未成熟睪丸組織玻璃化凍存效果有顯著影響，15%DMSO+15%EG組合是適宜未成熟大鼠睪丸組織玻璃化凍存的保護(hù)劑濃度方案，同時(shí)，仍有必要針對(duì)特定使用對(duì)象進(jìn)一步探索適宜的玻璃化方案，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論支持。