陳培林，孫青，熊風，李觀貴，鐘惠嫻，萬才云，姚志鴻，曾勇*

(1. 深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳 518045；2. 深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045)

輔助生殖技術(shù)中的多胎妊娠問題與多種并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)，對母嬰的健康造成極大的威脅，引起大家的普遍關(guān)注[1-2]。選擇性單囊胚移植被認為是解決輔助生殖多胎妊娠的有效方法[3-4]。然而，要保證單囊胚移植的臨床妊娠率，就必須挑選出種植潛力最好的囊胚用于移植。

在人類早期胚胎發(fā)育過程中，胚胎發(fā)育速度不盡相同，這就導致囊胚形成時間并不一致。不同時間形成的囊胚其種植潛能是否存在差異，目前仍存在爭議[5]。針對該問題，本研究回顧性分析2013年1月至2017年8月，在深圳中山泌尿外科醫(yī)院行凍融單囊胚移植的1 761個周期的臨床資料，探討不同囊胚形成時間對凍融單囊胚移植周期臨床結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對象

收集2013年1月至2017年8月在深圳中山泌尿外科醫(yī)院行凍融單囊胚移植的患者。入選標準：移植胚胎為第5天(D5)或D6形成的囊胚。排除標準：移植胚胎為D7形成的囊胚。共納入1 761個周期。本研究納入患者在治療開始前均經(jīng)倫理委員會批準通過，及患者知情同意。

二、研究方法

1. 分組：根據(jù)囊胚形成時間分為2組，其中移植胚胎為D5形成囊胚的定義為A組(n=834)，移植胚胎為D6形成囊胚的定義為B組(n=927)。再根據(jù)兩組移植囊胚的質(zhì)量將A、B組分別分為兩個亞組，其中移植胚胎為D5形成優(yōu)質(zhì)囊胚的定義為A1組(n=635)；移植胚胎為D5形成非優(yōu)質(zhì)囊胚的定義為A2組(n=199)；移植胚胎為D6形成優(yōu)質(zhì)囊胚的定義為B1組(n=418)，移植胚胎為D6形成非優(yōu)質(zhì)囊胚的定義為B2組(n=509)。

2. 囊胚培養(yǎng)：IVF或ICSI獲得的胚胎，經(jīng)患者知情同意后，全部或剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)。D5和D6分別觀察囊胚形成情況。

3.囊胚擴張程度評分：根據(jù)囊胚腔的大小及囊胚孵化程度，將其分為6個期，用數(shù)字1～6來表示。1期：早期有腔室囊胚，囊胚腔小于胚胎總體積的1/2；2期：囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的1/2；3期：完全擴張囊胚，囊胚腔完全占據(jù)了胚胎的總體積；4期：擴張囊胚，囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變薄；5期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6期：孵出的囊胚，囊胚全部從透明帶中逸出。

4.內(nèi)細胞團評分：根據(jù)細胞數(shù)量和緊密程度，分為3個級別，用字母A、B、C來表示。A級：細胞數(shù)目多，排列緊密；B級：細胞數(shù)目少，排列松散；C級：細胞數(shù)目很少。

5.滋養(yǎng)層細胞評分：根據(jù)細胞數(shù)量和緊密程度，分為3個級別，用字母A、B、C來表示。A級：上皮細胞層由較多的細胞組成，結(jié)構(gòu)致密；B級：上皮細胞層由不多的細胞組成，結(jié)構(gòu)松散；C級：上皮細胞層由稀疏的細胞組成。

6.囊胚評級：根據(jù)囊胚評分情況將囊胚分為3級。1級囊胚：3期及以上評分不含有C；2級囊胚：3期及以上評分中含有1個C的囊胚；3級囊胚：3期及以上評分中含有2個C的囊胚。其中評級為1級的囊胚定義為優(yōu)質(zhì)囊胚。

7.本中心的囊胚移植和冷凍標準：本中心只移植或冷凍評級1級或2級的囊胚。

8.囊胚冷凍與解凍：本中心冷凍解凍操作按照玻璃化冷凍、解凍試劑盒(Kitazato Biophama，日本)說明書進行。移植日當天解凍囊胚，行激光輔助孵化后放入Quinn’s囊胚培養(yǎng)液(SAGE，美國)中，置于37℃、5%CO2、5%O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h，觀察囊胚擴張情況。

9.子宮內(nèi)膜準備及囊胚移植：(1)自然周期：根據(jù)陰道超聲檢測，月經(jīng)天數(shù)≥10 d，優(yōu)勢卵泡直徑≥14 mm，子宮內(nèi)膜達到7～8 mm以上，排卵后第5天進行凍融囊胚移植。(2)人工周期：月經(jīng)第3日起口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳制藥，德國)4 mg/d×5 d，根據(jù)內(nèi)膜情況調(diào)整劑量和天數(shù)。15 d后B超監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度7～8 mm以上時，肌肉注射黃體酮60 mg/d至移植日，第6天進行凍融囊胚移植。

10.囊胚移植及黃體支持：B超引導下行囊胚移植。自移植次日改用黃體酮凝膠(雪諾酮，默克雪蘭諾，瑞士)90 mg/d陰道給藥，直至移植后11 d測血β-HCG。

11.結(jié)局判斷及觀察指標：移植后11 d測血β-HCG，β-HCG≥5 U/L定義為β-HCG陽性。移植28 d后，超聲下可見孕囊定義為臨床妊娠。

HCG陽性率=β-HCG陽性周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率=妊娠12周內(nèi)流產(chǎn)的周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；早產(chǎn)率=早產(chǎn)周期數(shù)/活產(chǎn)周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、單個優(yōu)質(zhì)凍融囊胚移植周期各組患者基本資料及妊娠結(jié)局比較

A1組與B1組患者的移植年齡、不孕年限比較均有顯著性差異(P<0.05)，體重指數(shù)(BMI)比較則無顯著性差異(P>0.05)(表1)。兩組患者的妊娠結(jié)局比較，HCG陽性率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及早產(chǎn)率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表1 單個優(yōu)質(zhì)凍融囊胚移植周期各組患者基本資料比較(-±s)

注：與B1組比較，*P<0.05

表2 單個優(yōu)質(zhì)凍融囊胚移植周期各組患者妊娠結(jié)局比較(%)

二、單個非優(yōu)質(zhì)凍融囊胚移植周期各組患者基本資料及妊娠結(jié)局比較

A2組與B2組患者的不孕年限、BMI比較均無顯著性差異(P>0.05)，移植年齡組間比較存在顯著性差異(P<0.05)(表3)。兩組的早期流產(chǎn)率、早產(chǎn)率比較均無顯著性差異(P>0.05)，A2組的活產(chǎn)率顯著高于B2組(P<0.05)，A2組的HCG陽性率、臨床妊娠率極顯著高于B2組(P<0.01)(表4)。

表3 單個非優(yōu)質(zhì)凍融囊胚移植周期各組患者基本資料(-±s)

注：與B2組比較，*P<0.05

表4 單個非優(yōu)質(zhì)凍融囊胚移植周期各組患者妊娠結(jié)局 (%)

注：與B2組比較，*P<0.05，**P<0.01

三、多因素Logistic回歸分析

以臨床妊娠為因變量，以女方移植年齡、不孕年限、女方BMI、囊胚形成時間做多因素Logistic回歸分析。對于優(yōu)胚組，女方BMI、不孕年限、囊胚形成時間對臨床妊娠的影響無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而女方年齡[OR=0.895，95%CI(0.868，0.922)]對臨床妊娠的影響有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表5)。對于非優(yōu)胚組，女方移植年齡、女方BMI、不孕年限對臨床妊娠的影響無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而囊胚形成時間[OR=2.240，95%CI(1.592，3.152)]對臨床妊娠的影響有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表6)。

表5 多因素Logistic回歸分析各因素對單個優(yōu)質(zhì)囊胚凍融移植臨床妊娠率的影響

表6 多因素Logistic回歸分析各因素對單個非優(yōu)質(zhì)囊胚冷凍移植臨床妊娠率的影響

討 論

多胎妊娠會引起多種并發(fā)癥，嚴重威脅母嬰健康，是輔助生殖技術(shù)中亟待解決的問題[1，6]。選擇性單胚胎移植是目前解決多胎妊娠最有效的方法[3]，由于相較于卵裂期胚胎，囊胚移植具有更好的臨床結(jié)局[7-8]，選擇性單囊胚移植已成為大家關(guān)注的焦點。然而，減少移植胚胎數(shù)目勢必會引起臨床妊娠率的降低[4]，為保證囊胚移植的妊娠率，必須選擇更具發(fā)育潛能的胚胎。目前對于胚胎發(fā)育潛能的評估多是基于胚胎形態(tài)學評分[9-10]，然而由于胚胎發(fā)育速度并不相同，這會導致相同評分的囊胚可能形成時間并不一致。囊胚形成時間的差異是否會影響囊胚移植的妊娠結(jié)局目前尚存在爭議[5]。

2005年Barrenetxea等[11]的研究表明，對于新鮮移植周期，移植D5囊胚的妊娠結(jié)局顯著好于移植D6囊胚。在凍融移植周期中，有研究認為移植D5、D6囊胚其妊娠結(jié)局無顯著性差異[12-13]，而王雪等[14]的研究認為移植D5囊胚其臨床妊娠率、種植率等指標均優(yōu)于移植D6囊胚，李彩虹等[15]的研究也得到了類似的結(jié)論。譚巧等[5]對35周歲以下女性移植不同等級及不同形成時間凍融囊胚的臨床結(jié)局進行了研究，結(jié)果顯示優(yōu)胚組D5囊胚的移植妊娠結(jié)局與D6囊胚類似，非優(yōu)胚組D5囊胚的移植妊娠結(jié)局好于D6囊胚，但無顯著性差異。本研究分析了不同囊胚形成時間對凍融單囊胚移植周期臨床結(jié)局的影響，我們根據(jù)囊胚形成時間以及囊胚質(zhì)量進行分組，研究結(jié)果顯示對于優(yōu)胚組，A1組移植D5囊胚的β-HCG陽性率(60.79% vs. 57.89%)、臨床妊娠率(52.44% vs. 49.28%)、早產(chǎn)率(10.81% vs. 15.28%)等妊娠結(jié)局均有優(yōu)于B1組的趨勢，但尚無顯著性差異(P>0.05)；早期流產(chǎn)率(22.22% vs. 23.79%)、活產(chǎn)率(34.96% vs. 34.45%)與B1組相似。A1組患者的年齡[(33.44±4.52) vs.(34.23±4.36)]及不孕年限[(3.24±2.52)vs.(3.87±3.14)]均顯著小于B1組(P<0.05)，結(jié)合多因素Logistic回歸分析結(jié)果，A1組妊娠結(jié)局略優(yōu)于B1組，可能是年齡因素造成的(OR=0.895，P<0.01)，囊胚形成時間不會顯著影響優(yōu)胚組妊娠結(jié)局(OR=1.063，P>0.05)。

對于非優(yōu)胚組，A2組D5囊胚移植的β-HCG陽性率(56.78% vs. 39.10%)、臨床妊娠率(48.74% vs. 29.86%)、活產(chǎn)率(28.64% vs. 20.04%)均顯著高于B2組(P<0.05)；兩組的早期流產(chǎn)率(34.02% vs. 25.00%)、早產(chǎn)率(8.77% vs. 8.82%)比較均無顯著性差異(P>0.05)。盡管兩組年齡[(33.90±4.29)vs.(34.81±5.22)]存在顯著性差異(P<0.05)，但結(jié)合多因素Logistic回歸分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)年齡并非影響該組臨床妊娠的顯著因素(OR=0.969，P>0.05)，而囊胚形成時間是影響兩組間臨床妊娠率差異的重要因素(OR=2.240，P<0.01)。

我們的結(jié)論與Yang等[16]的研究相似。究其原因，可能是不同形成時間囊胚的非整倍體率差異造成的。Yang等[16]的研究顯示，在優(yōu)胚組，D5、D6囊胚的非整倍體率并無顯著性差異，而在非優(yōu)胚組，D6囊胚的非整倍體率高于D5囊胚組。眾所周知，非整倍體是導致胚胎凋亡、種植失敗或自然流產(chǎn)的重要因素[17-18]。對于優(yōu)胚組，由于D5、D6囊胚的非整倍體率并無明顯差異，因此，無論移植D5囊胚還是D6囊胚其妊娠結(jié)局并無顯著性差異。而對于非優(yōu)胚組，由于D5囊胚有更低的非整倍體率，因此移植D5囊胚的妊娠結(jié)局顯著優(yōu)于移植D6囊胚。

綜上所述，我們的研究顯示在凍融單囊胚移植時，若移植胚胎為優(yōu)胚，則囊胚形成時間對于臨床結(jié)局無顯著影響；但當移植囊胚為非優(yōu)胚時，囊胚形成時間對臨床結(jié)局有顯著影響，此時選擇D5形成的囊胚對臨床結(jié)局更有利。當然我們的研究還存在一定的局限性，受限于樣本數(shù)量，我們并未根據(jù)內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)細胞評分進一步分組，評估二者對妊娠結(jié)局的影響。有研究認為相同評級不同內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞的評分會造成妊娠結(jié)局的差異[19]，因此在非優(yōu)質(zhì)囊胚組中妊娠結(jié)局的差異可能由此因素造成，還需進一步研究確認。