李娜，李凡，胡高升，趙玥，賈景明

沈陽(yáng)藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016

昆蟲含有大量的昆蟲腸道菌，包括許多昆蟲致病菌及互惠共生菌等。一些腸道微生物生活在昆蟲腸道內(nèi)并與宿主一起進(jìn)行協(xié)同進(jìn)化，在進(jìn)化的過(guò)程中逐漸形成了自己獨(dú)特的代謝途徑，并且發(fā)生了形態(tài)化及基因型變化[1-2]。研究表明，一些腸道共生菌能夠?yàn)樗拗魈峁┮恍┧拗餍枰闹匾獱I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，幫助宿主抵御一些致病菌的抗生素，還會(huì)產(chǎn)生一些活性次生代謝產(chǎn)物，促進(jìn)宿主的生長(zhǎng)，提升競(jìng)爭(zhēng)能力。昆蟲與微生物保持多樣的共生關(guān)系，這種共生關(guān)系可能對(duì)宿主昆蟲具有重要的生存意義，如半翅目蚜蟲共生菌Buchnerasp.和紅兵臭蟲共生菌Coriobacteriumsp.為宿主提供昆蟲不能合成的維生素B族化合物[3-4]；白蟻腸道菌Bacteroides和Citrobacter為宿主昆蟲清理腸道內(nèi)的含氮有機(jī)廢物[5]；某些兼性共生菌可以產(chǎn)生活性小分子代謝產(chǎn)物，幫助宿主昆蟲抵御致病菌和外來(lái)天敵入侵等。研究者將共生菌產(chǎn)生的活性小分子應(yīng)用于藥學(xué)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，某些小分子具有明顯的抗菌、抗癌和免疫抑制活性，提示昆蟲共生菌作為新藥物來(lái)源的可能性[6-7]。作為新天然產(chǎn)物的來(lái)源之一，昆蟲共生菌正受到越來(lái)越多藥物化學(xué)家的關(guān)注。

中華地鱉蟲EupolyphagasinensisWalker又名地鱉蟲、土鱉蟲、土元等，為節(jié)肢動(dòng)物門昆蟲綱蜚蠊目鱉蠊科昆蟲，是《中華人民共和國(guó)藥典》收載的常用中藥地鱉蟲的主要來(lái)源之一，雌蟲全體入藥，具有破瘀血、續(xù)筋骨等作用，用于筋骨折傷、瘀血經(jīng)閉、癥瘕痞塊[8]。

近年來(lái)，關(guān)于地鱉蟲的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用及保健作用方面[9]，而關(guān)于地鱉蟲腸道內(nèi)生真菌的研究未見報(bào)道。因此，本文對(duì)中華地鱉蟲腸道內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離鑒定，并對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了抑菌活性研究，旨在為發(fā)現(xiàn)新型活性天然產(chǎn)物提供一條重要途徑。

1 材料

1.1 試劑與儀器

蔗糖(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；瓊脂粉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；瓊脂糖(西班牙Biowest)；2×TaqMaster Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)；硫酸鏈霉素、青霉素、EZup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程公司)；Marker DM2000(康為世紀(jì)生物科技有限公司)，其余試劑均為分析純。

超凈工作臺(tái)(上海樹立儀器儀表有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；振蕩培養(yǎng)箱ZQTY-50F(上海知楚儀器有限公司)；PCR儀(美國(guó)Life Technologies公司)；電泳儀EPS-300、水平電泳槽HE-120、Tanon-1600凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技限公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)TGL-16(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計(jì)[尤尼柯(上海)儀器有限公司]；恒溫水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

研究材料為地鱉蟲，購(gòu)于臨沂市興榮土元養(yǎng)殖合作社，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院賈景明教授鑒定為中華地鱉蟲E.sinensis。

1.3 供試用病原菌

抑菌實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株為金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501、白色念珠菌CMCC(F)98001，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

1.4 培養(yǎng)基(自制)

麥芽浸汁瓊脂培養(yǎng)基(Malt Extracts Agar medium，MEA)：生麥芽20 g，加水煮沸30 min后過(guò)濾取汁，加入蔗糖20 g、蛋白胨1 g、瓊脂20 g、去離子水1000 mL，高壓滅菌備用。不加瓊脂為相應(yīng)液體培養(yǎng)基(ME)。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g、去離子水1000 mL，高壓滅菌備用。沙氏培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、氯化鈉5 g、瓊脂14 g、去離子水1000 mL，高壓滅菌備用。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌分離及純化

地鱉蟲饑餓24 h，無(wú)菌條件下，3.5%次氯酸鈉消毒2 min，75%乙醇浸泡3 min，無(wú)菌水沖洗5次，吸取最后一次沖洗液200 μL涂布平板，用于表面消毒檢查。用無(wú)菌剪刀解剖蟲體，取前腸和中腸置于無(wú)菌研缽中，加無(wú)菌水充分研磨，渦旋后離心，取上清液1 mL，十倍稀釋法稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等5個(gè)濃度(g·mL-1)，每個(gè)濃度取200 μL涂布于MEA培養(yǎng)基中，28 ℃倒置培養(yǎng)。待平板長(zhǎng)出菌落后，反復(fù)多次劃線培養(yǎng)進(jìn)行分離純化，得到單菌落。

2.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取

將已純化的菌株，接種至裝有75 mL ME培養(yǎng)基的150 mL錐形瓶中，于28 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)3 d作為種子液，再以5%的接種量接種到ME培養(yǎng)基中，180 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d，雙層濾紙過(guò)濾后離心，取上清，過(guò)0.22 μm濾膜，用于抑菌活性初篩。將抑菌活性較好的內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)7 d后，發(fā)酵液用4～6層紗布過(guò)濾后，乙酸乙酯及正丁醇等體積萃取3次，濃縮萃取液得發(fā)酵產(chǎn)物浸膏，甲醇溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性

采用濾紙片法[10]進(jìn)行內(nèi)生真菌的抑菌活性研究。將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌，室溫活化5 h后接種至相應(yīng)的液體培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基)于28 ℃，160 r·min-1搖床中發(fā)酵培養(yǎng)至A600為0.5。分別移取上述菌液各200 μL，分別均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板和沙氏固體培養(yǎng)基平板。將內(nèi)生真菌發(fā)酵液從冰箱取出，將無(wú)菌濾紙片分別放于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，吸取發(fā)酵液至無(wú)菌培養(yǎng)皿中，浸泡2 h后，用無(wú)菌鑷子夾取濾紙片，在培養(yǎng)皿邊緣處刮去多余液體，貼于實(shí)驗(yàn)菌株平板。其中金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌組設(shè)置硫酸鏈霉素(10 mg·mL-1)為相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照，0.9%氯化鈉溶液為陰性對(duì)照；白色念菌珠組設(shè)置制霉菌素(0.1 mg·mL-1)為陽(yáng)性對(duì)照，0.9%氯化鈉溶液為陰性對(duì)照。將貼好濾紙片的平板于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24 h，觀察抑菌圈大小并測(cè)量。將抑菌效果較好的菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行萃取，用甲醇將乙酸乙酯層、正丁醇層及水層浸膏配成質(zhì)量濃度為30 mg·mL-1的待測(cè)樣品，將無(wú)菌濾紙片分別放于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，吸取待測(cè)樣品滴至無(wú)菌培養(yǎng)皿中，浸泡2 h，待甲醇完全揮干后，用無(wú)菌鑷子夾取濾紙片，貼于實(shí)驗(yàn)菌株平板。將貼好濾紙片的平板于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24 h，觀察抑菌圈大小并測(cè)量。

2.4 內(nèi)生真菌的鑒定

將抑菌活性較好的菌株(DB-1)接種至液體培養(yǎng)基，于28 ℃，180 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d，試劑盒法提取DNA，采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min；55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃后延伸5 min；4 ℃保溫2 min，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送蘇州金唯智生物科技公司進(jìn)行序列測(cè)定，所得序列在NCBI/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性分析。

2.5 內(nèi)生真菌生長(zhǎng)曲線

取菌種接種至裝有200 mL ME培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶，于28 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d后，以5%的接種量將種子液接種至裝有200 mL ME培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，于28 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每天定時(shí)取3瓶，將菌絲和菌液分離，用蒸餾水洗凈菌絲上的菌液后放在蒸發(fā)皿中，放入60 ℃烘箱中烘干后稱質(zhì)量，分別記錄10 d菌絲體的干質(zhì)量。以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌絲體干質(zhì)量為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

3 結(jié)果

3.1 內(nèi)生真菌的分離

在表面消毒效果檢驗(yàn)中，最后一次漂洗液涂板培養(yǎng)平板中，未發(fā)現(xiàn)有微生物生長(zhǎng)，表明蟲體的表面消毒效果良好，證明所分離得到的內(nèi)生真菌來(lái)源于蟲體腸道內(nèi)部。通過(guò)分離純化，從地鱉蟲腸道共分離內(nèi)生真菌8株。分別命名為DB-1～DB-8。

3.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵液的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

篩選出來(lái)的8株地鱉蟲腸道內(nèi)生真菌的抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 八株地鱉蟲內(nèi)生真菌對(duì)供試病原菌的抑菌結(jié)果

注：-表示無(wú)抑菌圈；+表示有抑菌圈。

由表1可知，菌株DB-1對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌都有一定的抑菌作用，其余菌株則對(duì)3株供試病原菌均沒(méi)有抑菌作用，故選定DB-1進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3.3 菌種鑒定結(jié)果

DB-1菌種的rDNA ITS序列結(jié)果如下：GTGAGGGGAAGT CTGATCCGAGGTCAACATTTCAGAA-GTTGGGTGTTTTACGGACGTGGACGCGCCGCGCTCC-CGGTGCGAGTTGTGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGC-TGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGCCGGGAT-CCCGTCTTAG-GGGCTCCCGAGGTCCCCAACGCCGA-CCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCG-GACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAA-TGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGC-AATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCA-TCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTT-TTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAGAA-ATAACGTCCGCGAGGGGACTACAGAAAAGAGTTTG-GTTGGTCCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTG-CGACGCACCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACA-GTTTGGTATGGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAA-CTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCAACAGAA-ACCTTGTTACGACTATACTTCCCACCAAGGTGAACA-AAAAAAAGGTTGCCCGGCGGGGGTAGCCCGGGGGG-GGTCCACCCGACCCGGGCCGCGGAAGGACCACAAA-CTTATACTGTAGTCCTTCGGGATTTTATTTCTA。將序列結(jié)果在 NCBI(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)菌株DB-1的擴(kuò)增片段的堿基序列與GenBank中Trichodermaatroviride的rDNA ITS序列(序列號(hào)為MG972798.1)同源性高達(dá)99%，由此證明DB-1為深綠木霉Trichodermaatroviride。圖1為菌株DB-1的菌落形態(tài)圖。

圖1 菌株DB-1的菌落形態(tài)圖

3.4 生長(zhǎng)曲線

菌株DB-1菌絲干質(zhì)量見表2，生長(zhǎng)曲線見圖2。

表2 菌株DB-1菌絲干質(zhì)量(n=30)

圖2 中華地鱉腸道內(nèi)生真菌DB-1生長(zhǎng)曲線圖

由圖2可知，DB-1菌株的生長(zhǎng)周期為7～8 d，在第8天菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大，然后逐漸降低，之后達(dá)到平穩(wěn)期。因此，研究DB-1菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性時(shí)，選擇培養(yǎng)時(shí)間為8 d。

3.5 DB-1菌株抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

DB-1菌株發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性結(jié)果見圖3，抑菌圈直徑大小見表3。由表3可知，只有乙酸乙酯層具有抑菌活性，其他各部位(正丁醇層及水層)均沒(méi)有抑菌活性。

表3 DB-1發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性測(cè)試 cm

注：1E為乙酸乙酯層；1B為正丁醇層；1H 為水層；+為陽(yáng)性對(duì)照；—為陰性對(duì)照。

4 討論

與化學(xué)合成藥物相比，微生物藥物具有微生物來(lái)源豐富；次級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎，活性獨(dú)特；生長(zhǎng)周期短、代謝易于控制，可工業(yè)化生產(chǎn)且無(wú)環(huán)境壓力；可有目的進(jìn)行生物合成改造等諸多優(yōu)勢(shì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

地鱉蟲是一種食性雜、不傳瘟、繁殖快的一類藥用昆蟲，非常容易飼養(yǎng)，猜測(cè)其腸道內(nèi)應(yīng)該具有抑制病原菌的內(nèi)生菌。因此，本文從地鱉蟲腸道中分離出8株內(nèi)生真菌，其中一株對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌具有抑制活性，經(jīng)過(guò)鑒定為深綠木霉Trichodermaatroviride。深綠木霉為木霉屬TrichodermaPers.ex Fr.真菌，在分類上隸屬于半知菌類、叢梗孢目、叢梗孢科、叢梗孢科單胞亞科、頭孢霉族[11]，廣泛存在于植物根際土壤、葉圍、種子以及球莖等生態(tài)環(huán)境中[12]，是重要的酶和抗生素的生產(chǎn)菌株，主要產(chǎn)纖維素酶和丁質(zhì)酶類以及木霉素、膠霉素、綠木霉素和抗菌肽等，是迄今為止用于防治植物病害的生防菌研究中利用最多的植物病原拮抗真菌[13]。

圖3 DB-1菌株發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性結(jié)果

本文對(duì)深綠木霉的發(fā)酵產(chǎn)物利用乙酸乙酯及正丁醇進(jìn)行了萃取，在對(duì)各萃取部位進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)只有乙酸乙酯層具有抑菌活性，正丁醇層及水層均沒(méi)有抑菌活性，由此判定抑菌活性成分存在于乙酸乙酯層。但是，抑菌成分是什么，是否為抗生素類或者其他成分，是本課題組正在研究的內(nèi)容。

因此，本課題組接下來(lái)對(duì)其發(fā)酵液中抑菌活性成分如何提取、產(chǎn)量與發(fā)酵條件之間有無(wú)關(guān)系以及活性成分能否作為藥用資源開發(fā)利用等問(wèn)題進(jìn)行研究。另外，在DB-1發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液有一定的香味，其抑菌作用是否與其香味成分有關(guān)系以及其香味成分是什么，也是本課題組接下來(lái)要研究的工作，以期為篩選和研發(fā)新型藥物提供參考。