呂經(jīng)緯，李晶峰，邊學(xué)峰，張楠茜，張輝，孫佳明

長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)/吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117

鹿茸CerviCornuPantotrichum為鹿科動(dòng)物梅花鹿CervusnipponTemminck或馬鹿CervuselaphusLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]。其性溫，味甘、咸，歸肝、腎經(jīng)，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品[2]，具有壯腎陽(yáng)、益精血、強(qiáng)筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒[1]的功能。鹿茸是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能夠完全再生的哺乳動(dòng)物器官[3]，研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、多肽、脂類、礦物質(zhì)、激素、多胺、生長(zhǎng)因子等成分[4-5]，是古今中外通用的名貴中藥材?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鹿茸具有壯腎陽(yáng)、促智并改善記憶障礙、抗抑郁、抗衰老、抗疲勞、抗肝損傷、保護(hù)心肌、調(diào)節(jié)血糖、提高免疫功能、抗腫瘤及性激素樣作用等多種藥理活性[6]。

雖然有關(guān)鹿茸化學(xué)成分、藥理機(jī)制及臨床應(yīng)用的研究不斷涌現(xiàn)[7-9]，但均未系統(tǒng)、整體地分析鹿茸中成分、靶點(diǎn)、通路和疾病的相互關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、整合藥理學(xué)等概念的相繼提出，以及分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，為闡明中醫(yī)藥科學(xué)內(nèi)涵提供了新的思路與方法，其整合生物信息學(xué)、分子生物學(xué)及各大數(shù)據(jù)庫(kù)信息，系統(tǒng)地研究“成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”之間相互作用，探究中醫(yī)藥“多組分、多靶點(diǎn)、多通路”的藥理機(jī)制，與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治、組方配伍、協(xié)同增效等原則不謀而合[10]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)方法，探索鹿茸主要物質(zhì)基礎(chǔ)、關(guān)鍵靶點(diǎn)、疾病之間的相互作用關(guān)系，為進(jìn)一步闡明鹿茸藥理機(jī)制提供新的方法與思路。

1 材料與方法

1.1 鹿茸成分與靶點(diǎn)挖掘

利用中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析平臺(tái)BATMAN-TCM(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php/Home/Index/index)挖掘鹿茸的化學(xué)成分，并利用該服務(wù)器的“成分-靶點(diǎn)相似性”原理，設(shè)置閥值“Score cutoff=30”，計(jì)算化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)，最后利用Cytoscape網(wǎng)絡(luò)圖形處理軟件構(gòu)建“化學(xué)成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。BATMAN-TCM收錄了包括TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)中的46 914個(gè)方劑、8159種中藥及25 210個(gè)中藥化合物，該平臺(tái)的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)功能是基于Perlman等[11]的SITAR理念(Similarity-based Inference of drug-TARgets)，利用藥物靶點(diǎn)相似性原理來預(yù)測(cè)已知中藥化合物的潛在靶點(diǎn)，具有速度快、準(zhǔn)確度較高的特點(diǎn)。

1.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

為了明確鹿茸靶點(diǎn)群中的“關(guān)鍵靶點(diǎn)”，利用STRING平臺(tái)(https：//string-db.org/)構(gòu)建靶點(diǎn)群蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI network)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”(智人)進(jìn)行操作，最低相互作用閥值設(shè)為中等“medium confidence=0.4”，并用Cytoscape軟件的“Network Analyzer”功能對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，?jì)算網(wǎng)絡(luò)整體的“節(jié)點(diǎn)度值分布(Node Degree Distribution)、介數(shù)中心性(Betweenness Centrality)”2個(gè)重要拓?fù)鋮?shù)，以Degree和Betweenness的均數(shù)為“卡值”，選取Degree和Betweenness同時(shí)在卡值之上的靶點(diǎn)為“關(guān)鍵靶點(diǎn)”，研究關(guān)鍵靶點(diǎn)可能的藥理作用。Degree反映了網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)目，Betweenness是網(wǎng)絡(luò)中所有最短路徑中經(jīng)過該節(jié)點(diǎn)的路徑數(shù)目與最短路徑總數(shù)之比，Degree與Betweenness是衡量一個(gè)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中重要性的兩個(gè)主要拓?fù)鋮?shù)，也是判斷一個(gè)靶蛋白是否為“關(guān)鍵靶點(diǎn)”的重要依據(jù)[12]。

1.3 GO生物過程富集

關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO生物過程注釋利用Cytoscape軟件中的“ClueGO”插件對(duì)鹿茸的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO(gene ontology)生物過程富集，建立GO生物過程層級(jí)關(guān)系圖，分析關(guān)鍵靶點(diǎn)在體內(nèi)可能的生物過程。

1.4 KEGG信號(hào)通路分析

信號(hào)通路分析利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)將鹿茸關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes)信號(hào)通路富集，物種與背景設(shè)置均為“Homo sapiens”(智人)進(jìn)行操作，研究關(guān)鍵靶點(diǎn)投射的KEGG信號(hào)通路與疾病之間的相互關(guān)系，明確鹿茸可能的藥理機(jī)制。

1.5 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建和分析

Cytoscape 3.6.1構(gòu)建鹿茸“成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，利用Network Analyzer插件計(jì)算Degree值，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及信號(hào)通路相互之間的關(guān)系，研究鹿茸可能針對(duì)潛在靶點(diǎn)和信號(hào)通路的治療作用及其發(fā)揮藥效的主要機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 鹿茸成分與潛在靶點(diǎn)

在BATMAN-TCM服務(wù)器共挖掘到鹿茸成分14個(gè)(見表1)，對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)306個(gè)。如圖1所示，14個(gè)正方形節(jié)點(diǎn)為鹿茸中的成分，306個(gè)六邊形節(jié)點(diǎn)代表鹿茸的潛在靶點(diǎn)，363條邊代表靶點(diǎn)和化學(xué)成分之間的相互作用，充分體現(xiàn)了鹿茸多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

2.2 蛋白互作與關(guān)鍵靶點(diǎn)分析

為研究各潛在靶點(diǎn)在體內(nèi)的相互作用關(guān)系，尋找關(guān)鍵靶點(diǎn)，將潛在靶點(diǎn)蛋白群進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析(見圖2)，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)212個(gè)靶蛋白可以發(fā)生相互作用，產(chǎn)生488條代表蛋白之間相互作用的邊，其中度值、介數(shù)越大顏色越深，說明蛋白相互作用越強(qiáng)。PPI網(wǎng)絡(luò)平均度值為4.60，平均介數(shù)為3.56×10-2，度值、介數(shù)超過平均值的靶蛋白共有26個(gè)(見表2)，說明這26個(gè)靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置，可能是鹿茸實(shí)現(xiàn)藥理效應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.3 GO生物過程富集

按照P值(校正)<0.01的標(biāo)準(zhǔn)，利用ClueGO插件對(duì)26個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物過程富集研究。結(jié)果26個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)可以參與體內(nèi)57個(gè)GO生物過程(見圖3)，包括G蛋白耦合受體蛋白信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)、一氧化氮生物合成、前列腺發(fā)育、鈉離子輸送的調(diào)節(jié)等方面調(diào)控。

表1 鹿茸篩選后得到的14個(gè)成分

注： 表示鹿茸成分； 表示潛在靶點(diǎn)。圖1 鹿茸14個(gè)活性成分-306個(gè)靶蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

注： 顏色由淺到深代表度值、介數(shù)從小到大。圖2 鹿茸靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

序號(hào)靶點(diǎn)中文名稱靶基因Uniprot IDDegreeBetweenness1Thyroid receptor-interacting protein 2甲狀腺受體相互作用蛋白2MED1Q15648220.230 2 2Adenylate cyclase type 1腺苷酸環(huán)化酶1型ADCY1Q08828180.071 4 3Retinoic acid receptor RXR-alpha 視黃醇受體RXR-αRXRAP19793160.111 8 4C-X-C chemokine receptor type 4CXC趨化因子受體4型CXCR4P61073140.060 2 5Estrogen receptor雌激素受體ESR1P03372130.174 5 6D(2)dopamine receptorD(2)多巴胺受體DRD2P14416130.070 3 7Mu-type opioid receptorMu型阿片受體OPRM1P35372130.058 5 8RAC-alpha serine/threonine-protein kinaseRAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT1P31749110.376 4 9Retinoic acid receptor RXR-gamma視黃醇受體RXR-γRXRGP48443110.238 5 10Cytosolic purine 5′-nucleotidase細(xì)胞溶質(zhì)嘌呤5′-核苷酸酶NT5C2P49902110.091 4 11Sodium channel subunit beta-2鈉通道亞基β-2SCN2BO60939100.059 9 12Sodium channel subunit beta-1鈉通道亞基β-1SCN1BQ0769990.057 4 13Sodium channel subunit beta-3鈉通道亞基β-3SCN3BQ9NY7290.057 4 14Retinoic acid receptor alpha維甲酸受體αRARAP1027690.228 1 15Catenin beta-1連環(huán)蛋白β-1CTNNB1P3522280.088 3 16Mothers against decapentaplegic homolog 3母親反對(duì)decapentaplegic同系物3SMAD3P8402280.049 0 17Beta-adrenergic receptor kinase 1β-腎上腺素能受體激酶1ADRBK1P2509880.374 1 18cGMP-inhibited 3′,5′-cyclic phosphodiesterase BcGMP抑制3′,5′-環(huán)磷酸二酯酶BPDE3BQ1337070.209 5 19Growth factor receptor-bound protein 2生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2GRB2P6299360.041 7 20Lecithin retinol acyltransferase卵磷脂視黃醇酰基轉(zhuǎn)移酶LRATO9523760.036 4

續(xù)表2

注： 表示病毒對(duì)宿主形態(tài)或生理的調(diào)節(jié)； 表示G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號(hào)通路負(fù)調(diào)節(jié)； 表示一氧化氮生物合成過程； 表示前列腺發(fā)育； 表示環(huán)化酶活性的調(diào)節(jié)； 表示分支結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生的調(diào)節(jié)； 表示鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)。圖3 鹿茸57個(gè)GO生物過程

2.4 KEGG信號(hào)通路分析

將26個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集研究，結(jié)果按照l(shuí)gP值共篩選出7大類68條信號(hào)通路，如圖4、表3所示，包括雌激素信號(hào)通路、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等特定類型癌癥通路，縫隙連接、Rap1信號(hào)等免疫系統(tǒng)通路，趨化因子等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、Wnt信號(hào)等抗腫瘤通路以及物質(zhì)依賴性、內(nèi)分泌系統(tǒng)等通路。

2.5 生物通路分析

通過Cytoscape 3.6.1構(gòu)建“成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖5)，包含108個(gè)節(jié)點(diǎn)(14個(gè)成分、26個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)和68條生物信號(hào)通路)和285條邊，其四邊形代表鹿茸成分，圓形代表關(guān)鍵靶點(diǎn)，三角形代表信號(hào)通路，線代表成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路之間的關(guān)系。其度值較大的成分有三磷酸腺苷、視黃醇、17-β-雌二醇，度值分別為10、6、3，其分別與10個(gè)、6個(gè)、3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)相關(guān)。其度值較大的靶點(diǎn)有AKT1、GRB2、PRKCA，度值分別為51、34、33，其分別與51條、34條、33條信號(hào)通路相關(guān)。其度值較大的信號(hào)通路有癌癥信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、癌蛋白多糖信號(hào)通路，度值分別為10、7、6，其分別與10個(gè)、7個(gè)、6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)相關(guān)。

注： 顏色越深代表富集到該通路的基因數(shù)越多。圖4 鹿茸7條主要KEGG信號(hào)通路富集圖

3 討論

通過對(duì)鹿茸“成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鹿茸14個(gè)成分分別調(diào)控26個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，Clue GO分析得到7個(gè)子簇57個(gè)GO生物過程及7大類68條KEGG信號(hào)通路，呈現(xiàn)出鹿茸多成分、多靶點(diǎn)、多通路整合調(diào)節(jié)作用的網(wǎng)絡(luò)特點(diǎn)。其中，鹿茸成分三磷酸腺苷、視黃醇和氨基葡萄糖分別通過ADCY1、AKT1、CTNNB1、GRB2、SMAD3、PRKCA、RARA、RXRA、RXRG、CXCR4 10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)直接作用于癌癥信號(hào)通路(表3，1)。將網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行相互印證可見，三磷酸腺苷具有較強(qiáng)的抗人食管癌細(xì)胞增殖作用[13]，視黃醇代謝相關(guān)基因LRAT和RDH12對(duì)宮頸鱗癌細(xì)胞具有抑制效果[14]，氨基葡萄糖具有抗腫瘤和免疫增強(qiáng)作用[15]。PI3K/Akt信號(hào)通路(表3，37)是癌癥信號(hào)通路(表3，1)中重要途徑，是調(diào)控腫瘤發(fā)生的重要通路之一[16]。

表3 鹿茸7大類68條KEGG信號(hào)通路及相關(guān)靶基因

續(xù)表3

續(xù)表3

注： 表示鹿茸成分； 表示潛在靶點(diǎn)； 表示潛在通路。圖5 鹿茸成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

徐婷婷[17]報(bào)道特異性誘導(dǎo)視黃醇X受體RXRA形成RXRA-LBD四聚體可阻止PI3K/AKT信號(hào)通路激活從而抑制癌細(xì)胞增殖。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示視黃醇可直接作用于視黃醇X受體RXRA，推測(cè)鹿茸可能通過作用于此靶點(diǎn)從而影響癌癥信號(hào)通路發(fā)揮藥效。從圖5分析推測(cè)三磷酸腺苷、視黃醇和氨基葡萄糖是鹿茸潛在的抗腫瘤成分，并通過癌癥通路、PI3K/AKT等信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，鄒三鵬等[18]研究發(fā)現(xiàn)17-β-雌二醇能夠有效抑制MHCC97H肝癌細(xì)胞的侵襲；曹容華等[19]研究表明接種腫瘤后同時(shí)注射前列腺素E1 7 d對(duì)腫瘤有抑制作用。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示鹿茸中17-β-雌二醇、前列腺素E1能夠作用到ESR1、Med1、PRKCA關(guān)鍵靶點(diǎn)，推測(cè)鹿茸可能通過作用于這些靶點(diǎn)從而影響癌蛋白多糖等信號(hào)通路發(fā)揮藥效。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道以及網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，表明鹿茸在治療腫瘤疾病方面具有潛在的優(yōu)勢(shì)。

盧賀等[20]發(fā)現(xiàn)鹿茸調(diào)節(jié)cAMP/cGMP信號(hào)通路(表3，59)歸經(jīng)于腎臟、肝臟發(fā)揮治療骨關(guān)節(jié)炎的作用，并可以激活Smad3蛋白(表2，16)，調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖和分化促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)，從而對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠起到治療作用[21]。石曉征等[22]發(fā)現(xiàn)梅花鹿茸Ⅰ型膠原可激活Wnt信號(hào)通路(表3，68)，顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度。李文凱等[23]研究表明三磷酸腺苷可通過促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)化治療骨質(zhì)疏松。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示三磷酸腺苷可通過AKT1蛋白直接作用于骨細(xì)胞分化信號(hào)通路(表3，32)；同時(shí)，17-β-雌二醇也能夠通過AKT1靶點(diǎn)直接作用于骨細(xì)胞分化信號(hào)通路，表明鹿茸可能通過作用于此靶點(diǎn)影響骨細(xì)胞分化信號(hào)通路發(fā)揮藥效，推測(cè)鹿茸在抗骨關(guān)節(jié)炎、治療骨質(zhì)疏松癥方面具有潛在的優(yōu)勢(shì)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘鹿茸中含有17-β-雌二醇、雌酮等雌激素，長(zhǎng)期服用外源性雌激素是乳腺癌發(fā)生的高危因素之一[24]。有研究證實(shí)短期(小于5年)、單純雌激素制劑的藥物應(yīng)用不增加乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，而長(zhǎng)期(超過10年)、雌孕激素聯(lián)合用藥等情況將增加乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[25-27]，由此可見乳腺癌危險(xiǎn)的增加取決于雌激素的劑量和治療時(shí)間。鹿茸中雌激素主要包括雌二醇、雌酮，其中梅花鹿茸中雌二醇、雌酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.103、0.289 μg·g-1，馬鹿茸中雌二醇、雌酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.090、0.434 μg·g-1[28]，其雌激素含量較低，且鹿茸作為中藥長(zhǎng)期服用的情況也很少見。但值得注意的是，對(duì)于有乳腺癌病史的患者，還應(yīng)充分評(píng)估患者風(fēng)險(xiǎn)，準(zhǔn)確掌握鹿茸用藥指征。

本文從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探討并揭示了鹿茸的主要成分、作用靶點(diǎn)、相關(guān)生物信號(hào)通路。網(wǎng)絡(luò)分析推測(cè)鹿茸除了在抗骨關(guān)節(jié)炎、治療骨質(zhì)疏松癥的作用之外，在抗腫瘤方面具有潛在的優(yōu)勢(shì)。本文為進(jìn)一步研究鹿茸的作用機(jī)制提供理論參考，為鹿茸的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。