張雪艷，袁媛，胡啟跳，蔣超，方成武

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012

龜甲是中國的傳統(tǒng)名貴藥材之一，來源于龜科動物烏龜Chinemysreevesii(Gray)的背甲及腹甲，具滋陰潛陽、益腎強(qiáng)骨、養(yǎng)血補(bǔ)心、固經(jīng)止崩之功效[1]。龜甲在臨床上應(yīng)用廣泛，且為細(xì)貴中藥材，極易混偽，對破碎的、不完整的龜甲也無法進(jìn)行客觀、準(zhǔn)確鑒別。龜甲混偽品有近20種，包括巴西龜、馬來閉殼龜、黃緣閉殼龜、黃喉擬水龜、平胸龜、地龜、四眼斑水龜、印度棱背龜、廟龜、鋸緣龜、凹甲陸龜、緬甸陸龜?shù)萚2-6]，尤其是巴西龜在龜甲偽品中極為常見。

近年來DNA分子鑒別技術(shù)快速發(fā)展，位點特異性PCR、DNA測序等技術(shù)開始用于動物類藥材的鑒別，多種動物藥材已建立分子鑒別方法[7-11]。劉曉帆等[12]已使用基于COI序列的DNA條形碼技術(shù)鑒定龜甲及其混偽品，鄧瑩等[13]根據(jù)Cytb序列設(shè)計特異性引物，使用酚-三氯甲烷法提取DNA并建立了龜甲特異性PCR鑒別方法。高分辨率熔解曲線技術(shù)(High resolution melting，HRM)因其具有高通量、低成本、簡單快捷、和閉管操作等優(yōu)點[14-15]，避免了溴化乙錠、聚丙烯酰胺等有害試劑的使用和紫外照射，且有望檢出正偽摻雜的樣品，在中藥DNA分子鑒定領(lǐng)域已有應(yīng)用[16-19]。

本研究建立了龜甲藥材和飲片DNA快速提取方法，建立并比較了龜甲特異性PCR鑒別方法和高分辨率熔解曲線鑒別方法的優(yōu)劣，進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)考察，可快速、準(zhǔn)確鑒別龜甲及其常見混偽品。

1 材料

1.1 藥材

龜甲對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院(批號：121494-201604)。樣品購自河北安國藥材市場、安徽亳州藥材市場、廣州玉林藥材市場、云南昆明藥材市場。共獲得龜甲與其混偽品42批，實驗樣品經(jīng)張繼教授、李軍德教授鑒定，存于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，見表1。

1.2 試劑

柱式骨骼DNAout試劑盒(北京天恩澤公司，批號：91102-50)；ExTaq(Takara公司，批號：RR001Q)；SpeedSTAR HSTaq(Takara公司，批號：RR070Q)；2×T5 Super PCR Mix(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，批號：TSE005)；rTaqDNA(Takara公司，批號：DR100A)；金牌Mix Green PCR(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，批號：TSE101)；MightyAmp DNA聚合酶(Takara公司，批號：R071Q)；LightCycler480 High Resolution Melting Master(Roche公司，批號：4909631001)；2000 bp DNA Marker(Takara公司，批號：3427Q)。

表1 龜甲樣品

1.3 儀器

VeritiTM型、GeneAmp 9700型(Applied Biosystems公司)；TC-512型(Techne 公司)；PTC-100型(Gene公司)；PCR儀、LightCycler480型實時熒光定量PCR儀(Roche公司)；SYNGENE 凝膠成像系統(tǒng)(GENE公司)。

2 方法

2.1 DNA提取

取藥材約50 mg，粉碎成粉末。取粉末20 mg，置2 mL離心管中，使用柱式骨骼DNA提取試劑盒提取DNA，加入1000 μL 65 ℃預(yù)熱的提取緩沖液，充分混勻；65 ℃水浴30 min；加入300 μL緩沖液及200 μL三氯甲烷；充分混勻，12 000 r·min-1下離心5 min；取500 μL上清至1個新的1.5 mL離心管，加入500 μL上柱緩沖液，充分混勻；加入DNA純化柱中，12 000 r·min-1下離心1 min；棄穿透液；加入洗脫液500 μL，12 000 r·min-1下離心1 min；棄穿透液，加入洗脫液500 μL，12 000 r·min-1下再離心1 min；棄穿透液，離心DNA純化柱2 min；加入50 μL無菌雙蒸水，室溫放置2 min后12 000 r·min-1下離心1 min，取穿透液稀釋10倍用于PCR反應(yīng)。

2.2 特異性引物的設(shè)計

從GenBank查找烏龜及巴西龜、黃喉擬水龜、擬鱷龜、平胸龜、中華花龜、緬甸陸龜偽品的COI序列。用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對，找到差異片段，并設(shè)計鑒別引物：GJ-360.F 5′-GCTTTGGAAACTGACTTGTACCTTTAATG-3′和GJ-360.R 5′-GAGAGTAGTAATAGGACGGCTGTAATAAGTTCA-3′。

2.3 龜甲特異性PCR鑒別方法

在200 μL離心管中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)總體積為25 μL，包括10×PCR緩沖液2.5 μL、dNTP(2.5 mmol·L-1)1 μL、鑒別引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL、TaqDNA聚合酶(5 U·L-1)0.2 μL和DNA模板1 μL，用無菌水補(bǔ)足反應(yīng)體積。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)35次(95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保溫結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。并考察主要參數(shù)：PCR退火溫度、PCR循環(huán)次數(shù)、DNA模板用量、DNA聚合酶種類和PCR儀類型對龜甲特異性PCR鑒別方法的影響，獲得最優(yōu)鑒別條件。

2.4 熔解曲線分析

分別以龜甲藥材DNA為模板，調(diào)整DNA濃度在合適范圍內(nèi)，在Light Cycler 480型實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而后直接進(jìn)行熔解曲線分析。PCR反應(yīng)總體積20 μL，PCR反應(yīng)體系：2×High Resolution Melting Master Mix 10 μL、MgCl2(25 mmol·L-1)1.6 μL、COI通用引物序列RonM-tl 5′-TGTAAAAGGAGGGCCAGTGGMGCMCCMGATATR-GCATTCCC-3′；VRL-tl 5′-CAGGAAACAGCTATGACTAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′。引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL、模板DNA 1 μL、加ddH2O補(bǔ)齊到20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，40循環(huán)；而后進(jìn)入高分辨熔解曲線分析程序：95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，66 ℃ 1 s；40 ℃冷卻10 s，每秒采集25個數(shù)據(jù)，獲得龜甲及其混偽品的熔解曲線。

2.5 熔解曲線模型的建立

隨機(jī)選取3批龜甲藥材，使用COI通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析；利用羅氏Lightcycler 480 Software 1.5軟件建立龜類熔解曲線模型，對其精密度、重復(fù)性進(jìn)行考察。

2.6 PCR反應(yīng)體系適用性分析

考察模板DNA用量、引物濃度、鎂離子濃度對熔解曲線峰形和Tm值的影響，從而確定可依據(jù)峰形和Tm值鑒別龜甲藥材真?zhèn)蔚倪m合條件。

3 結(jié)果與分析

3.1 龜甲的特異性PCR鑒別方法條件確定

使用設(shè)計的龜甲特異性鑒別引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并依次考察PCR鑒別體系和鑒別條件關(guān)鍵因素對龜甲特異性PCR鑒別方法的影響，以獲得最優(yōu)鑒別條件。當(dāng)退火溫度設(shè)定為58、60、62 ℃，結(jié)果表明，在58～60 ℃時，龜甲正品均能擴(kuò)增得到360 bp的條帶，混偽品緬甸陸龜、黃緣擬水龜、中華花龜、四眼斑水龜、巴西龜?shù)染鶡o條帶，使用相同方法依次對PCR循環(huán)次數(shù)、模板DNA用量、Taq酶種類和PCR儀型號進(jìn)行考察，當(dāng)退火溫度為60 ℃，PCR循環(huán)次數(shù)為30個循環(huán)，模板DNA濃度為20 ng·μL-1，使用無5′-3′的TaqDNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增時獲得最優(yōu)鑒別結(jié)果，龜甲正品均擴(kuò)增獲得360 bp特異性鑒別條帶，混偽品無條帶。其中Taq酶種類和模板DNA用量對鑒別結(jié)果有較大影響，高保真DNA聚合酶擴(kuò)增保真率雖高，但效率低，產(chǎn)物獲得率低，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。模板DNA用量過高(100 ng)易出現(xiàn)假陽性鑒別結(jié)果，混偽品均可出現(xiàn)假陽性條帶，見表2。

3.2 龜甲特異性PCR鑒別方法的適用性考察

采用3.1確定的特異性PCR鑒別體系，對24批龜甲樣品及18批偽品進(jìn)行鑒別(見圖1～2)，結(jié)果表明，該體系能穩(wěn)定、準(zhǔn)確地鑒別龜甲藥材和飲片。

注：M.DL2000 Marker；P.陽性對照；N.空白對照(dd H2O為模板)；1～3.龜甲；4.巴西龜；5.馬來龜；6.擬鱷龜；7.鋸緣龜；8.緬甸陸龜；9.平胸龜；10.黃喉擬水龜；11.中華花龜；12.黃緣閉殼龜；13.四眼斑水龜；14.安南龜。圖1 龜甲正偽品鑒別結(jié)果

表2 龜甲特異性PCR鑒別條件考察結(jié)果

注：M.DL2000 Marker；P.陽性對照；N.空白對照(dd H2O為模板)；1～6.不同市場來源龜甲藥材；7～9.龜甲飲片。圖2 不同批次龜甲特異性PCR鑒別結(jié)果

3.3 龜甲的高分辨率熔解曲線鑒別方法的建立

3.3.1 熔解曲線模型的建立 使用高分辨率熔解曲線技術(shù)對龜甲進(jìn)行鑒別，建立其熔解曲線模型。隨機(jī)選擇不同來源的龜甲藥材3批，分別提取其DNA，使用COI通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行熔解曲線分析，結(jié)果表明，龜甲熔解曲線為雙峰，其Tm值分別為(83.15±0.76)、(87.53±0.69)℃，RSD分別為0.91%、0.80%。對同一批龜甲DNA樣品，進(jìn)行熔解曲線分析，重復(fù)3次，其熔解曲線峰形一致，RSD值在分別在0.30%～0.80%、0.20%～0.80%(見圖3)。

注：A.3批龜甲藥材熔解曲線；B.龜甲COI熔解曲線參考模型。圖3 龜甲藥材熔解曲線模型的建立

3.3.2 高分辨率熔解曲線技術(shù)鑒別反應(yīng)體系適用性分析 選取龜甲DNA，測定其濃度，并依次稀釋為87.9、25.0、3.5、0.7 ng·μL-1，以COI作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得熔解曲線，并分析不同濃度模板DNA對龜甲熔解曲線峰形和Tm值的影響。結(jié)果表明，模板DNA在3.5～87.9 ng·μL-1均獲得較為均一的熔解曲線，可用于龜甲藥材分子鑒別(見圖4A)。

注：A.不同濃度模板DNA對龜甲熔解曲線峰形和Tm值的影響；B.不同引物濃度對龜甲熔解曲線峰形和Tm值的影響；C.不同濃度MgCl2對龜甲熔解曲線峰形的影響。圖4 龜甲高分辨率熔解曲線鑒別條件考察結(jié)果

依據(jù)Light Cycler 480 High Resolution Melting Master說明書中引物最適濃度為0.1～0.3 μmol·L-1，在20 μL反應(yīng)體系中分別加入0.2、0.4、0.6、0.8 μL引物(母液濃度為10 μmol·L-1)，獲得其熔解曲線，并分析不同引物濃度對龜甲熔解曲線峰形和Tm值的影響。結(jié)果表明，引物為0.2 μmol·L-1時可形成穩(wěn)定的熔解曲線峰形(見圖4B)。

在20 μL反應(yīng)體系中分別加入1.5、2.0、2.5、3.0 μL的MgCl2溶液(母液濃度為25 mmol·L-1)，獲得其熔解曲線，并分析不同引物濃度對龜甲熔解曲線峰形和Tm值的影響。結(jié)果表明，引物濃度為2.0 mmol·L-1時可形成穩(wěn)定的熔解曲線峰形(見圖4C)。

3.3.3 高分辨率熔解曲線技術(shù)鑒別龜甲正偽品 選取4種常見龜甲偽品巴西龜、馬來龜、擬鱷龜、黃喉擬水龜，分別提取其總DNA，進(jìn)行熔解曲線分析，獲得偽品熔解曲線。對龜甲及其偽品熔解曲線進(jìn)行比較，結(jié)果表明，龜甲混偽品HRM曲線均與正品有顯著差異，可以相互區(qū)分(見圖5)。

圖5 使用高分辨率熔解曲線技術(shù)鑒別龜甲正品及其混偽品(以巴西龜為例)

4 討論

PCR鑒別準(zhǔn)確性取決于DNA提取質(zhì)量。動物藥材來源廣泛，其中，部分動物藥材來自于甲殼、皮膜、分泌物、角質(zhì)物等。由于這些藥材在市場上流通時間長、加之高溫等因素，使得藥材DNA嚴(yán)重降解，從而給DNA提取造成麻煩。此外，Taq酶種類和模板DNA的用量也會對鑒別結(jié)果有較大影響，高保真DNA聚合酶擴(kuò)增保真率雖高，但效率低，產(chǎn)物獲得率低，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。模板DNA用量過高(100 ng)易出現(xiàn)假陽性鑒別結(jié)果，混偽品均可出現(xiàn)假陽性條帶。另外，筆者對比了十二烷基硫酸鈉法(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)、高鹽低pH法及3種不同的柱式DNA提取試劑盒對龜甲DNA提取的效果，發(fā)現(xiàn)在不進(jìn)行脫鈣的情況下，僅柱式骨骼DNA提取試劑盒對龜甲藥材和蒸制飲片具有較好的提取效果，基于硅膠膜離心柱的方法相對其他方法操作更為簡單，易于標(biāo)準(zhǔn)化，且在角、甲類動物藥材上具有良好的提取效果，已用于羚羊角、鹿角等動物藥材的DNA提取[20-21]，有望拓展到其他角、甲類藥材的提取。

本文建立了快速簡便的龜甲DNA提取和DNA鑒定方法，使用特異性PCR鑒別可在4 h內(nèi)獲得鑒定結(jié)果，該方法既可用于龜甲藥材亦可用于龜甲飲片，有助于龜甲的質(zhì)量控制，提高龜甲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。同時本文也建立了龜甲的高分辨率熔解曲線技術(shù)鑒別方法，使用HRM鑒別可在3 h內(nèi)獲得鑒別結(jié)果，且HRM可替代凝膠電泳對PCR產(chǎn)物及其酶切片段進(jìn)行檢測，避免使用溴化乙錠、聚丙烯酰胺等有害試劑和紫外照射。然而，在對龜甲飲片進(jìn)行擴(kuò)增時發(fā)現(xiàn)，無論是使用通用引物L(fēng)1490/H2198或引物RonM-tl/VRL-tl均無法擴(kuò)出條帶，推測是龜甲飲片經(jīng)高溫水煮后DNA嚴(yán)重降解，難以擴(kuò)增獲得400 bp以上的條帶，表明直接使用通用引物結(jié)合HRM的方法無法鑒別龜甲飲片，下一步可考慮針對龜甲及其混偽品的序列差異，根據(jù)SNP位點設(shè)計引物，建立特異性的HRM鑒別方法[22-23]。