趙玉洋，周駿輝，袁媛，黃璐琦，金艷，蔣超

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700

麝香為麝科動(dòng)物林麝MoschusberezovskiiFlerov、馬麝M.sifanicusPrzewalski(M.c.sifanicusBüchner)或原麝M.moschiferusL.成熟雄體香囊中的干燥分泌物[1-2]。麝香為安宮牛黃丸、片仔癀等中成藥的重要藥味，具有開竅醒神、活血通經(jīng)、消腫止痛等功效，臨床應(yīng)用很廣，價(jià)格昂貴。近年來，麝科動(dòng)物野生居群快速減小[3-4]，天然麝香已不能滿足中藥臨床藥用的需求[5]，麝香藥材摻偽、混偽現(xiàn)象不斷出現(xiàn)，而麝香藥材及其香囊缺乏必要的性狀特征，鑒別困難。

DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA序列來進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)[6]。COI片段(Cytochrome c oxidase subunit 1)是最廣為接受的動(dòng)物藥材鑒定用DNA條形碼片段[7-10]，此外，其他片段如cytochrome b(Cyt b)，12S rRNA線粒體控制區(qū)control region(CR)也常用于動(dòng)物的分類和藥材的鑒別研究。已有研究通過提取麝類動(dòng)物的肌肉組織、毛發(fā)等的DNA，使用COI或Cyt b通用引物擴(kuò)增對(duì)麝類動(dòng)物進(jìn)行DNA條形碼鑒別[5，11-12]。然而，麝香藥材中殘留的DNA含量很少，降解嚴(yán)重，難以擴(kuò)出658 bp的全長(zhǎng)COI片段，致使DNA條形碼分子鑒定法難以用于麝香藥材的分子鑒定。微型DNA條形碼是從全長(zhǎng)序列中設(shè)計(jì)出新的PCR引物，用于擴(kuò)增短DNA片段(約100～300 bp)并進(jìn)行測(cè)序的一種方法[13]。源于COI的微型DNA條形碼序列可區(qū)分90%以上動(dòng)物物種[14-15]。本文根據(jù)麝香及其混偽品COI序列設(shè)計(jì)出一對(duì)微型DNA條形碼引物，可從肌肉組織、毛發(fā)、香囊及藥材中擴(kuò)出約180 bp的片段并能準(zhǔn)確區(qū)分麝香及其混偽品。

1 材料

1.1 樣品

共采集61批麝香及其混偽品樣品(見表1)，其中包括養(yǎng)殖場(chǎng)采集的林麝毛發(fā)15份、麝香2份，馬麝毛發(fā)10份、麝香1份，原麝毛殼4份、麝香5份，麝鼠原動(dòng)物6份、麝鼠香3份，常見混偽品雞、牛、羊、豬原動(dòng)物組織各3份，市售麝香毛殼2份、麝香仁2份。樣品采集后置-80 ℃冰箱存于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心。

表1 61批麝香及其混偽品樣品信息

1.2 試劑

Dneasy血液及組織核酸提取試劑盒(上海凱杰企業(yè)管理有限公司，批號(hào)：69506)，TIANamp微量DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，批號(hào)：DP316]，Wizard基因組DNA提取試劑盒(Promega公司，批號(hào)：A2360)，QIAamp糞便DNA提取試劑盒(上海凱杰企業(yè)管理有限公司，批號(hào)：51504)，SpeedSTAR HSTaqDNA聚合酶(批號(hào)：RR070A)，2000 bp DNA Marker(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BM101)，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，批號(hào)：02194004)。

1.3 儀器

VeritiTM型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Applied Biosystem公司)，SYNGENE SYNGENE型凝膠成像系統(tǒng)(GENE公司)；Nanodrop 2000型微量核酸定量分析儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

1.4 序列

從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載麝類及其混偽品COI序列或全長(zhǎng)線粒體DNA作為參考序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，其中全長(zhǎng)線粒體DNA序列Genbank登錄號(hào)：林麝(GQ329032.1，JX627397.1)，原麝(EU835717.1，JN632662.1)，馬麝(KP684123.1，JF700176.1)，安徽麝(M.anhuiensis，NC020017.1，KC013352.1)。

2 方法

2.1 DNA提取

肌肉組織、香囊使用DNeasy組織血液DNA提取試劑盒按說明書進(jìn)行DNA提取。對(duì)毛發(fā)樣品，取約20根帶有毛囊的毛發(fā)，剪除毛囊1 cm以上的部分，使用TIANamp微量DNA提取試劑盒(北京天根公司)提取DNA。

麝香仁使用改良CTAB法進(jìn)行DNA提?。喝△晗闳?.2 g置15 mL離心管中，加入60%乙醇10 mL，充分旋渦振蕩混勻，65 ℃水浴20 min，6000 g離心30 min，棄盡上層清液；沉淀加入已滅菌的CTAB提取液1000 μL，65 ℃水浴30 min；加入900 μL三氯甲烷-異戊醇抽提2次；轉(zhuǎn)移500 μL上層清液至另一新的2.0 mL的微量離心管中，加入330 μL異丙醇溶液，置-20 ℃放置1 h；12 000 g離心10 min，棄上層清液，加入70%乙醇2次；無水乙醇漂洗1次，12 000 g離心10 min，棄上層清液，揮干乙醇后，加入30 μL滅菌水溶解沉淀，-20 ℃保存。

2.2 引物設(shè)計(jì)

使用MEGA 6.0軟件對(duì)麝類及其混偽品物種COI序列及全線粒體基因組序列進(jìn)行序列比齊。在正品和混偽品DNA差異最大的區(qū)域兩側(cè)相對(duì)保守的位置使用Premier primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為120～200 bp，設(shè)計(jì)出麝香微型DNA條形碼鑒別引物對(duì)SX-178.F和SX178.F(見表2)。

2.3 PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)

25 μL PCR反應(yīng)體系包含10×FBI buffer 2.5 μL，dNTP(10 mmol·L-1)1.5 μL，上游及下游引物各0.5 μL，SpeedSTAR HSTaqDNA聚合酶(大連寶生物公司)0.2 μL，DNA模板(約10 ng·L-1)1 μL，加滅菌蒸餾水補(bǔ)足至25 μL。引物序列及PCR反應(yīng)程序見表2。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物，加入6×Loading buffer 5 μL(Takara公司)，混勻后于EtBr染色的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。

2.4 序列分析

取陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送由睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。使用BioEdit 7.2.6軟件對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行校對(duì)、去除引物序列及拼接，獲得對(duì)應(yīng)測(cè)序結(jié)果。從GenBank獲取的麝香及其混偽品物種COI序列及全線粒體基因組序列，與測(cè)序序列一起經(jīng)多重序列比對(duì)后利用MEGA 6.0基于Kimura-2-parameter模型計(jì)算種內(nèi)和種間遺傳距離，使用Neighbour Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)定為100次重復(fù)。

3 結(jié)果

3.1 麝類藥材全長(zhǎng)COI序列DNA條形碼鑒別能力

麝類不同材料DNA提取效率具有明顯區(qū)別，從肌肉或香囊囊皮中提取的DNA質(zhì)量濃度為60.2～230.7 ng·μL-1，毛發(fā)中則減至16.5～31.4 ng·μL-1。麝香藥材DNA提取效率最低，分別使用Wizard基因組DNA提取試劑盒、QIAamp糞便DNA提取試劑盒、DNeasy組織血液DNA提取試劑盒，經(jīng)典CTAB法及改良CTAB法進(jìn)行DNA提取，僅改良CTAB法能從麝香中提出DNA，質(zhì)量濃度為5.5～16.1 ng·μL-1，使用全長(zhǎng)COI引物L(fēng)CO1490和HCO2198進(jìn)行擴(kuò)增，肌肉組織、香囊和毛發(fā)樣品均能擴(kuò)出約700 bp條帶，而在麝香樣品中無條帶。

除5批毛發(fā)樣品PCR產(chǎn)物濃度過低，其余樣品均成功測(cè)序，測(cè)序峰圖經(jīng)校對(duì)、去除引物區(qū)后獲得658 bp全長(zhǎng)COI序列。將獲得的測(cè)序結(jié)果及GenBank上下載的序列比齊后進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，麝類及其混偽品COI序列包含419個(gè)保守位點(diǎn)和239個(gè)變異位點(diǎn)，其中158個(gè)為4個(gè)麝屬物種的變異位點(diǎn)。麝屬物種序列A、T、C、G堿基平均含量分別為27.4%、30.3%、26.1%、15.9%。各麝種種內(nèi)和種間遺傳距離有較大區(qū)別，安徽麝平均種內(nèi)遺傳距離為0，種間遺傳距離為0.145 8，安徽麝與林麝遺傳距離最近，為0.015。原麝具有最大的種內(nèi)距離(0.006)，是其他物種的2倍(見表3)。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，除安徽麝外其他物種均能聚成相對(duì)獨(dú)立的支(99%支持率)，麝香基原動(dòng)物原麝、林麝、馬麝與混偽品麝鼠、豬、牛、羊、雞等可相互鑒別(見圖1)。

表2 麝香DNA條形碼鑒別反應(yīng)條件

表3 麝香與其混偽品種內(nèi)、種間遺傳距離

圖1 麝香及其混偽品的COI NJ系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果

3.2 麝香微型DNA條形碼與全長(zhǎng)DNA條形碼鑒別能力的比較

COI全長(zhǎng)DNA條形碼引物無法從麝香樣品中擴(kuò)出條帶(見圖2，泳道1～3)，而使用微型DNA條形碼可從麝香和麝鼠香中擴(kuò)出約178 bp的條帶(見圖2)。序列去除引物區(qū)后長(zhǎng)132 bp，包含111個(gè)保守位點(diǎn)和21個(gè)變異位點(diǎn)，其中12個(gè)變異位點(diǎn)為麝屬4個(gè)物種的差異位點(diǎn)。麝香微型DNA條形碼多態(tài)性(10.81%)低于全長(zhǎng)DNA條形碼(24.01%)。麝屬物種微型DNA條形碼序列A、T、C、G堿基平均含量分別為31.3%、35.5%、15.2%、18.0%。該微型DNA條形碼引物也能從雞、羊、牛等混偽品中擴(kuò)出178 bp的條帶，且各物種均只有一種單倍型序列，種內(nèi)遺傳距離為0。林麝與馬麝、林麝與原麝、馬麝與原麝種間遺傳距離分別為0.066、0.063、0.029。構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹各物種均能聚成相對(duì)獨(dú)立的支(99%支持率)，麝香基原動(dòng)物原麝、林麝、馬麝與混偽品麝鼠、豬、牛、羊、雞等可相互鑒別，其鑒別結(jié)果與全長(zhǎng)DNA條形碼結(jié)果一致。

注：M.100 bp DNA ladder；1.林麝毛發(fā)；2.馬麝毛發(fā)；3.原麝肌肉；4～8.原麝香仁；9～10：林麝香仁；11.馬麝香仁；12～15.麝鼠香；16.空白對(duì)照(dd H2O為模板)；+表示明亮條帶；±表示暗條帶；-表示無條帶。圖2 麝香原動(dòng)物及麝香仁PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.3 市售樣品的DNA條形碼鑒別

所有麝香及麝鼠香樣品，包括2批標(biāo)為“原麝”的毛殼香囊(XN001～002)和2批標(biāo)為“麝香”的市售樣品，用于測(cè)試全長(zhǎng)DNA條形碼和微型DNA條形碼的鑒別能力，原麝、林麝、馬麝、麝鼠、豬、牛、羊、雞肌肉組織或毛發(fā)樣品各3批作為陽性對(duì)照同時(shí)實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增和測(cè)序后使用系統(tǒng)發(fā)育樹根據(jù)聚類結(jié)果進(jìn)行鑒別，結(jié)果樣品XN001和XN002全長(zhǎng)DNA條形碼和微型DNA條形碼均與雞聚為一支，表明其物種基原為雞。麝香樣品SX001和SX002只能用微型DNA條形碼鑒別，測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明其基原為原麝(見圖3)。

4 討論

麝是亞歐大陸珍稀瀕危物種，自1979年開始，所有麝屬物種均已列入《瀕危野生動(dòng)植物國(guó)際貿(mào)易公約》附錄進(jìn)行保護(hù)。目前天然麝香產(chǎn)量低，人工養(yǎng)殖規(guī)模小，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)麝香供需的巨大缺口導(dǎo)致我國(guó)麝資源面臨嚴(yán)重危機(jī)，存在較為嚴(yán)重的摻偽、混偽現(xiàn)象，需要建立準(zhǔn)確的基原鑒別方法。

盡管全長(zhǎng)DNA條形碼已用于多種動(dòng)物及其制品的分子鑒定，該方法用于麝香樣品鑒定仍存在較大不足。除改良的CTAB法外，其他多種DNA提取方法均無法從麝香樣品中回收DNA，且提取的DNA濃度均遠(yuǎn)低于肌肉組織和毛發(fā)樣品。改良CTAB法提出的DNA可能來源于麝香香囊囊皮或毛發(fā)脫落的微量細(xì)胞或組織碎片，其DNA含量很低、嚴(yán)重碎片化，且存在大量PCR抑制物，使用全長(zhǎng)DNA條形碼擴(kuò)增引物擴(kuò)增具有困難。

研究發(fā)現(xiàn)，高度降解或DNA含量低微的樣本可擴(kuò)出短PCR產(chǎn)物片段。而100 bp左右的微型DNA條形碼也具有與全長(zhǎng)DNA條形碼相似的物種鑒別能力[14，16-17]。本研究根據(jù)麝香及其混偽品COI序列差異，從中設(shè)計(jì)出短擴(kuò)增片段的通用引物對(duì)，可從原麝、林麝、馬麝與混偽品麝鼠、牛、羊、雞中擴(kuò)出178 bp的微型DNA條形碼條帶，該微型DNA條形碼片段與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的COI序列有98%～100%一致性。該結(jié)果表明，微型DNA條形碼可用于麝香藥材的鑒定，該方法也有望推廣至豬膽粉、熊膽粉、阿膠等DNA降解或DNA含量低微的材料，解決動(dòng)物類中藥鑒別難題。

注：A.全長(zhǎng)COI DNA條形碼；B.微型DNA條形碼。圖3 麝香藥材DNA條形碼NJ系統(tǒng)發(fā)育樹鑒別