來(lái)夢(mèng)茹，方昀，葛宇清，黃真，張光霽，程汝濱*

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053

海馬在中國(guó)素有“南方人參”之稱，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為其既善補(bǔ)腎壯陽(yáng)益精，治腎陽(yáng)虛衰之證，又能活血散結(jié)、消腫止痛、治徵瘕積聚和瘡腫等癥[1]。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載了5種藥用海馬，分別為小海馬Hippocampusmohnikei、大海馬H.kuda、刺海馬H.histrix、線紋海馬H.kelloggi、三斑海馬H.trimaculatus的干燥體，但對(duì)其性狀描述較為簡(jiǎn)略[2]。在中醫(yī)藥大健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展背景下，對(duì)海馬等傳統(tǒng)的名貴滋補(bǔ)類中藥的需求量日益增加。但天然海馬的產(chǎn)量本身不高，加之氣候和環(huán)境變化，導(dǎo)致我國(guó)海馬藥材的生產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足需求量，其中70%以上的海馬藥材資源需要依靠進(jìn)口。由于海馬動(dòng)物種類繁多，親緣關(guān)系和品種性狀相近，不易區(qū)分，導(dǎo)致近年來(lái)市場(chǎng)上的海馬品種較為混亂，摻偽摻假現(xiàn)象越來(lái)越頻繁，嚴(yán)重影響了海馬藥材臨床用藥安全[3-5]。

虎尾海馬H.comes作為流通在中藥市場(chǎng)上的藥用海馬偽品之一，主要分布于菲律賓、印度尼西亞、馬來(lái)西亞、泰國(guó)、新加坡等東南亞地區(qū)的近岸海域[6-7]。因過(guò)度捕撈和環(huán)境破壞，其在部分地區(qū)數(shù)量已經(jīng)減少了70%[8-9]。在藥材市場(chǎng)中，虎尾海馬常被作為刺海馬的偽品之一流通使用，關(guān)于虎尾海馬的研究處于起步階段，相關(guān)的文獻(xiàn)資料較少。不同海馬干燥體的外觀差異不明顯，鑒別難度較大，且海馬藥材常以藥材粉末形式流通，為海馬品種的鑒別帶來(lái)了極大的困難，故亟需建立有效的鑒定方法來(lái)改善市售海馬的流通現(xiàn)狀，提高海馬藥材的質(zhì)量。

目前對(duì)虎尾海馬的生藥學(xué)鑒定研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本文擬利用性狀鑒別聯(lián)合DNA條形碼鑒定技術(shù)對(duì)虎尾海馬進(jìn)行系統(tǒng)的生藥學(xué)研究，提供虎尾海馬典型的性狀和分子鑒別特征，為虎尾海馬的快速準(zhǔn)確鑒定提供技術(shù)保證，為后續(xù)的藥用海馬銷售市場(chǎng)規(guī)范和法規(guī)制定提供參考，為海馬藥材用藥安全管理奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥材

本實(shí)驗(yàn)共收集海馬藥材樣品28份，分別購(gòu)自安徽亳州、浙江磐安、山東威海的藥材市場(chǎng)和海馬養(yǎng)殖廠，包括虎尾海馬樣品20份，三斑海馬樣品4份，直立海馬樣品4份。經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院葛宇清副研究員鑒定，分別為虎尾海馬、三斑海馬和直立海馬。將所用樣品做好標(biāo)記，于干燥封口袋中避光保存，樣品保存于浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。同時(shí)在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載26條COI序列(線紋海馬H.kelloggi4條，大海馬H.kuda4條，刺海馬H.histrix4條，棘海馬H.spinosissimus4條，太平洋海馬H.ingens4條，小海馬H.mohnikei4條，擬海龍Syngnathoidesbiaculeatus和刁海龍Solegnathushardwickii各1條)。為保證下載序列與物種對(duì)應(yīng)關(guān)系的正確性，本文對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的26條COI序列一一進(jìn)行了NCBI-BLAST同源性比對(duì)分析，結(jié)果表明引用序列與其他同種海馬的COI序列同源性達(dá)98%以上，確保了引用序列的準(zhǔn)確性。樣本來(lái)源及其DNA條形碼序列詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 海馬樣品來(lái)源及COI序列信息

1.2 試劑

無(wú)水乙醇(西隴化工有限公司)；海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；瓊脂糖粉(Solarbio)；50×TAE緩沖液[生工生物工程(上海)股份有限公司]；DL2000 DNA Marker(TaRaKa公司)；6×Loading Buffer(TaRaKa公司)；溴化乙錠染料(Solarbio)；10×PCR buffer(TaRaKa公司)；dNTP Mix(TaRaKa公司)；r-Taq酶(TaRaKa公司)；引物COI由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.3 主要儀器設(shè)備

多功能精密電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；恒溫金屬浴鍋(上海培清實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一有限公司)；超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Amersham公司)；微波爐(青島海爾有限公司)；PCR儀、離心機(jī)[寶生物工程(大連)有限公司]。

2 方法

2.1 DNA提取

將20個(gè)虎尾海馬樣品進(jìn)行編號(hào)，用75%乙醇擦拭尾部，分別剪取約5 mg的尾部組織于EP管中，樣本的基因組總DNA均用DNA提取試劑盒(Takara公司)提取，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取。用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)樣本DNA的純度和濃度，置于-20 ℃保存。

2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

在COI序列通用擴(kuò)增引物L(fēng)CO1490/HCO2198的基礎(chǔ)上[10]，結(jié)合海馬屬已知COI基因的序列特點(diǎn)，優(yōu)化設(shè)計(jì)了虎尾海馬的COI基因的擴(kuò)增引物COI-F和COI-R，其中引物的序列信息如下，正向引物COI-F：5′-TTCTCAACTAATCACAAAGACATCGGCA-3′；反向引物COI-R：5′-ACTTCAGGRTGTCCRAAGAATCAG-AATAAG-3′。以樣品DNA作為模板，對(duì)樣品的COI序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，查閱文獻(xiàn)并結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況加以驗(yàn)證，優(yōu)化確定最佳擴(kuò)增體系與反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增[11]。采用的50 μL PCR擴(kuò)增體系：10×PCR buffer 5 μL，r-Taq酶0.5 μL，dNTP Mix 5 μL，上游引物(F)1 μL，下游引物(R)1 μL，模板DNA 5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，52 ℃退火1 min，72℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸15 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，參照DNA maker電泳條帶讀出PCR產(chǎn)物的大小和質(zhì)量(檢查條帶是否含有雜帶以及是否明亮單一)，純化后寄往上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序，樣品均采用ABI3730 XL測(cè)序儀雙向測(cè)序。

2.3 數(shù)據(jù)處理與序列分析

通過(guò)提取DNA、PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在BLAST中進(jìn)行比對(duì)。去除上下游引物序列，用Clustal W進(jìn)行序列比對(duì)，兩兩產(chǎn)生同源性，將20條虎尾海馬樣品的COI序列結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)詳見(jiàn)表1。利用MEGA 7.0軟件計(jì)算所測(cè)COI序列堿基組成和長(zhǎng)度，基于K2P雙參數(shù)模型計(jì)算并分析堿基變異位點(diǎn)、信息位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換/顛換、種內(nèi)及種間遺傳距離等；通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(NJ樹(shù))，分析虎尾海馬與其他海馬之間的親緣關(guān)系。

3 結(jié)果

3.1 性狀特征鑒別

虎尾海馬與線紋海馬、大海馬、三斑海馬和小海馬的形態(tài)區(qū)別明顯，但與刺海馬較為相似，容易混淆，因此常被作為刺海馬偽品在市場(chǎng)上流通。研究觀察表明，虎尾海馬最大體長(zhǎng)18.7 cm，體表多為褐色，體上棘狀突起較為明顯，呈鈕狀，尖端大多黑色，體環(huán)11個(gè)，尾環(huán)多為35～36個(gè)。頭冠矮小，頂端有5個(gè)明顯的圓形突起，吻長(zhǎng)不及頭長(zhǎng)1/2，鼻刺顯著，具雙頰棘。體輕，骨質(zhì)堅(jiān)硬，氣微腥，味微咸。虎尾海馬的體表多花斑，尾部有交替出現(xiàn)的斑紋，似老虎的尾巴，虎尾海馬因此而得名，這一特點(diǎn)是虎尾海馬最典型的鑒別特征，也是與刺海馬的重要區(qū)別點(diǎn)?；⑽埠ｑR干燥體形態(tài)如圖1所示。

圖1 虎尾海馬干燥體形態(tài)

3.2 條形碼序列和遺傳距離分析

本研究對(duì)20個(gè)虎尾海馬樣品的COI基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增及測(cè)序，采用MEGA 7.0軟件對(duì)COI序列的長(zhǎng)度、GC含量、堿基變異位點(diǎn)、信息位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換/顛換等進(jìn)行分析。結(jié)果表明，虎尾海馬的COI序列全長(zhǎng)649 bp，其中A、C、G、T堿基平均含量分別為27.13%、22.80%、16.93%、33.14%，G+C平均含量為39.73%，明顯低于A+T平均含量60.27%。COI基因序列在虎尾海馬不同個(gè)體之間存在一定的種內(nèi)變異率，其中保守位點(diǎn)643 bp，變異位點(diǎn)6 bp，變異率為0.92%。在20個(gè)虎尾海馬樣品中COI序列的信息位點(diǎn)為1 bp，轉(zhuǎn)換值為1，不存在顛倒現(xiàn)象。通過(guò)虎尾海馬COI序列的單倍型數(shù)目分析發(fā)現(xiàn)，虎尾海馬COI序列存在6種單倍型，其中主導(dǎo)地位的單倍型為A3，占樣品總量的70%，提示COI條形碼序列在虎尾海馬種內(nèi)存在一定的變異率，可用于后續(xù)的種群和地理進(jìn)化關(guān)系研究。

將獲得的20個(gè)虎尾海馬樣品COI序列和其他8種正偽品海馬樣品的COI序列進(jìn)行分析，基于K2P參數(shù)模型計(jì)算虎尾海馬COI基因的種內(nèi)和種間遺傳距離(見(jiàn)圖2)。結(jié)果表明，COI條形碼序列在虎尾海馬的最大種內(nèi)遺傳距離遠(yuǎn)小于其最小的種間遺傳距離，虎尾海馬COI序列的種內(nèi)遺傳距離為0.000～0.004 9，種內(nèi)平均遺傳距離為0.001 1，虎尾海馬與其他8種海馬樣品的種間遺傳距離為0.085 7～0.158 4，其中與直立海馬的種間遺傳距離最大(0.158 4)，與刺海馬的種間遺傳距離最小(0.085 7)，種間的平均遺傳距離為0.123 9?；⑽埠ｑRCOI序列最小種間遺傳距離是其最大種內(nèi)遺傳距離的17.5倍，存在顯著條形碼間隙(barcoding gap)，因此通過(guò)分析不同海馬樣品的COI序列，可將虎尾海馬與其他不同海馬品種明顯區(qū)分。

注：**P<0.01。圖2 虎尾海馬與其他海馬COI序列遺傳距離分析

3.3 NJ樹(shù)聚類分析

為進(jìn)一步確定COI序列在虎尾海馬和其他海馬正偽樣品間的鑒定能力，本文以K2P為參數(shù)模型，基于COI序列采用鄰接法構(gòu)建虎尾海馬、8種其他正偽品海馬和2種海龍的NJ樹(shù)，并通過(guò)bootstrap(1000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支支持率。圖3結(jié)果表明，虎尾海馬的20個(gè)樣品聚成一個(gè)大分支，其分支支持率為100%，明顯與其他8種海馬和2種海龍區(qū)分開(kāi)。此外，虎尾海馬內(nèi)部存在一定的分支亞群，但其分支支持率較低，且進(jìn)化樹(shù)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。虎尾海馬與刺海馬聚集成一分支，其支持率為95%，說(shuō)明虎尾海馬與刺海馬的親緣關(guān)系較近，可作為刺海馬的替代品用于后續(xù)的研究和開(kāi)發(fā)。通過(guò)COI序列的NJ樹(shù)聚類分析，可將虎尾海馬與其他的海馬品種明顯區(qū)分，為虎尾海馬的鑒定提供了快速準(zhǔn)確的方法。

4 討論

本文對(duì)虎尾海馬的性狀特征和DNA條形碼進(jìn)行了系統(tǒng)研究，明確了虎尾海馬與常見(jiàn)正偽品海馬樣品間最顯著的鑒別特征，對(duì)條形碼COI序列在虎尾海馬種內(nèi)種間的變異率、遺傳距離和NJ樹(shù)聚類進(jìn)行了分析，為虎尾海馬快速準(zhǔn)確鑒定技術(shù)的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的中藥材鑒定方法包括性狀鑒別、顯微鑒定、粉末鑒定和理化鑒別等。前期文獻(xiàn)報(bào)道不同海馬藥材粉末顯微鑒定過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)不同海馬品種來(lái)源的皮膚碎片、橫紋肌纖維、骨碎片和膠原纖維等顯微結(jié)構(gòu)多樣，但種間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，無(wú)法準(zhǔn)確鑒別海馬的種類[12]。因此，本研究采用了性狀鑒定和分子鑒定聯(lián)用技術(shù)，對(duì)中藥市場(chǎng)上常見(jiàn)的海馬偽品虎尾海馬進(jìn)行生藥學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，20條虎尾海馬樣品中存在6種單倍型，說(shuō)明COI條形碼序列在虎尾海馬種內(nèi)存在一定的變異率，可用于后續(xù)的種群和地理進(jìn)化關(guān)系研究。虎尾海馬的COI序列總長(zhǎng)度649 bp，堿基A+T的含量大于堿基G+C的含量，同時(shí)4種堿基中G的含量較其他3種堿基低，這與脊椎動(dòng)物線粒體DNA特點(diǎn)一致[13]。

圖3 基于COI序列構(gòu)建的虎尾海馬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

DNA條形碼(DNA Barcoding)是一種新興的生物分類學(xué)技術(shù)，近年來(lái)在中藥材鑒定及相關(guān)領(lǐng)域有迅速的發(fā)展和應(yīng)用。構(gòu)建中藥材DNA條形碼分子鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)，有利于對(duì)中藥材的準(zhǔn)確快速鑒定，為保證臨床用藥安全提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[14-15]。其中，COI基因是動(dòng)物藥DNA條形碼序列的首選序列，具有PCR擴(kuò)增效率高、進(jìn)化速率快、種間遺傳大于種內(nèi)遺傳等特點(diǎn)[16]。張輝等[17]選取了《中華人民共和國(guó)藥典》中45個(gè)動(dòng)物藥材進(jìn)行研究，結(jié)果表明COI序列作為DNA條形碼適用于《中華人民共和國(guó)藥典》中動(dòng)物藥材的鑒定，在藥用動(dòng)物的分類鑒定中可被廣泛應(yīng)用。趙群等[18]研究了6種蟾蜍及4種易混淆品的COI線粒體基因DNA序列，證明COI條形碼能夠準(zhǔn)確鑒定中華蟾蜍。張紅印等[19]研究了5個(gè)物種50份蜈蚣樣品，證實(shí)COI條形碼序列可以準(zhǔn)確鑒定蜈蚣及其混偽品。石林春等[20]研究了13個(gè)物種68份蛇蛻原藥材樣品，說(shuō)明COI條形碼不僅可以鑒定中藥材蛇蛻的3種基原，而且可以區(qū)分蛇蛻及其易混偽品。張改霞等[21]對(duì)21個(gè)物種211條海馬及其混偽品的COI序列進(jìn)行分析，證明COI序列能夠作為DNA條形碼準(zhǔn)確鑒定海馬及其混偽品?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果的啟發(fā)與指導(dǎo)，故本文采用COI基因作為鑒別虎尾海馬及其他正偽品海馬的DNA條形碼。研究結(jié)果表明，COI序列在虎尾海馬的種內(nèi)種間遺傳距離存在顯著條形碼間隙，NJ樹(shù)聚類分析表明，虎尾海馬單獨(dú)聚為一支，且節(jié)點(diǎn)支持率均達(dá)到100%，結(jié)果說(shuō)明了通過(guò)COI條形碼序列，可準(zhǔn)確區(qū)分虎尾海馬與其他市場(chǎng)常見(jiàn)的正偽品海馬，也進(jìn)一步證實(shí)了COI條形碼在動(dòng)物類中藥分類鑒定中的通用性和準(zhǔn)確性。本文的研究為COI條形碼準(zhǔn)確鑒定動(dòng)物藥虎尾海馬提供了分子依據(jù)，擴(kuò)充了DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)中藥用動(dòng)物序列，并為建立海馬分子鑒定技術(shù)流程奠定了基礎(chǔ)。

COI條形碼序列作為一種線粒體基因，被廣泛應(yīng)用于分類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究中。海馬作為重要的海洋藥用動(dòng)物，其均屬于海龍科海馬屬動(dòng)物，其親緣關(guān)系較近，利用單一條形碼在鑒定過(guò)程中有時(shí)無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分，影響分子鑒定的準(zhǔn)確性。蔣超等[4]研究表明，COI序列進(jìn)行NJ聚類分析時(shí)，管海馬、太平洋海馬、西非海馬、吻海馬、短吻海馬和南非海馬等共同聚為一大支，形成管海馬復(fù)合體，而無(wú)法相互區(qū)分。Chang等[22]已經(jīng)完成了虎尾海馬的線粒體全序列測(cè)定工作，為其后續(xù)的鑒定與進(jìn)化分析研究奠定了基礎(chǔ)。與單個(gè)線粒體條形碼基因相比，線粒體全序列包含的遺傳信息更豐富、變異位點(diǎn)和序列更多樣，故可通過(guò)不同藥材品種間的線粒體全序列比對(duì)，確定物種間最顯著的差異序列，為后續(xù)的DNA條形碼開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)[23-24]。課題組長(zhǎng)期致力于中藥資源的開(kāi)發(fā)和分子鑒定等方面的工作，近年來(lái)在海馬等海洋動(dòng)物類藥材的分類鑒定和DNA條形碼開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域做了部分工作。為建立適用于海馬藥材分子鑒定的技術(shù)體系，課題組通過(guò)獲得線粒體全基因組序列，建立海馬及其混偽品的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，明確不同海馬來(lái)源的分子進(jìn)化地位，篩選速度適中的可用于區(qū)分近緣海馬的DNA條形碼分子標(biāo)簽。目前，課題組已完成包括線紋海馬、棘海馬、南非海馬、歐洲海馬和駝背海馬在內(nèi)的7種海馬線粒體基因組全序列，為規(guī)范海馬中藥材市場(chǎng)的技術(shù)開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，也為我國(guó)海馬資源的遺傳多樣性保護(hù)、資源開(kāi)發(fā)與利用、海馬良種選育提供了數(shù)據(jù)支撐[25-30]。

虎尾海馬作為常見(jiàn)海馬藥材之一，來(lái)源廣，數(shù)量多，養(yǎng)殖存活率相對(duì)于其他海馬較高，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[31]。作為海馬屬的模式物種之一，虎尾海馬的全基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成[32]。測(cè)序和分析結(jié)果表明，相比于其他硬骨魚(yú)基因組，虎尾海馬基因組中蛋白質(zhì)和核甘酸的進(jìn)化速率最快，其丟失了大量的順式調(diào)控元件，這些缺失可能在海馬的演化革新中發(fā)揮重要作用?；⑽埠ｑR的全基因組信息，有助于揭示了海馬特異體形和獨(dú)特生活方式的形成原因，也為海馬資源的藥用價(jià)值開(kāi)發(fā)和瀕危資源保護(hù)技術(shù)運(yùn)用提供指導(dǎo)。本文在性狀鑒定和分子鑒定實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)虎尾海馬的性狀和DNA條形碼鑒定技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)開(kāi)發(fā)，為虎尾海馬后續(xù)開(kāi)發(fā)過(guò)程中品種的準(zhǔn)確鑒定提供了技術(shù)保證，也為海馬藥源的擴(kuò)展和養(yǎng)殖品種的引進(jìn)開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)參考和數(shù)據(jù)支撐。