陳水金 江 煜 陳樂春 陳進(jìn)城 林志剛△

神經(jīng)病理痛(Neuropathic pain，NP)是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或功能紊亂而造成的以痛覺過敏為主要表現(xiàn)的疼痛綜合征，臨床常見、多發(fā)[1～3]。臨床觀察發(fā)現(xiàn)推拿能有效干預(yù)神經(jīng)病理痛，但作用機(jī)制尚不明確。近年來，研究發(fā)現(xiàn)以N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體為代表的一類離子型谷氨酸(Glu)受體，尤其是2B亞單位(NR2B)的NMDA受體與NP關(guān)系密切，在NP的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4]。有學(xué)者采用坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷大鼠模型(CCI)研究NP大鼠脊髓背角NMDA受體NR2B亞基表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NR2B蛋白表達(dá)增加是導(dǎo)致大鼠神經(jīng)病理痛的原因之一[4～6]。本研究通過觀察推拿手法對(duì)CCI大鼠背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角NMDAR2B的表達(dá)，探討推拿手法鎮(zhèn)痛的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量為180～220 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證：SCXK(滬2014-0002)，單籠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后按照隨機(jī)數(shù)字表法分成空白組、假手術(shù)組(分離坐骨神經(jīng)但不進(jìn)行結(jié)扎)、CCI模型組、CCI模型+推拿組，每組8只。

1.2 主要儀器與試劑von-Frey纖毛(美國(guó)Stolting公司)、無線觸覺力測(cè)量指套(美國(guó)Finger TPS公司)、熱痛儀(美國(guó)IITC Life Science)、高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)、超聲波細(xì)胞破碎儀(美國(guó)BRANSON公司)、垂直電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司)、電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、Automatic凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)、Image La成像及分析軟件(美國(guó)Bio-Rad公司)、兔抗NR2B多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)、小鼠抗β-actin單抗(美國(guó)Jackson公司)、羊抗兔HRP IgG二抗(美國(guó)Jackson公司)、BCA蛋白定量試劑盒、ECL反應(yīng)液(美國(guó)Millipore公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 神經(jīng)病理痛模型的建立參照Bennett G J的方法稍作改進(jìn)建立大鼠CCI模型[7]。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉后，側(cè)臥位固定，消毒備皮，于大鼠右股骨中段后方約1 cm處平行于股骨切開皮膚、暴露肌肉，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)主干，用4-0鉻制羊腸線分3道結(jié)扎坐骨神經(jīng)，每道間隔約1 mm，然后逐層縫合，腹腔注射硫酸阿米卡星(10 mg/kg)預(yù)防感染。

1.3.2 神經(jīng)病理痛模型的驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)采用Von-Frey方法測(cè)試機(jī)械足反射閾值(PWT)及Hargreaves方法測(cè)試熱縮足反射潛伏期(PWL)，以驗(yàn)證CCI模型是否為疼痛行為表現(xiàn)穩(wěn)定的動(dòng)物模型，測(cè)定時(shí)間、次數(shù)及方法等同之前的文獻(xiàn)報(bào)道[8]。

1.3.3 推拿干預(yù)方法推拿組于造模后第4～17天實(shí)施每天1次、每次10 min的推拿干預(yù)。術(shù)者用右手對(duì)大鼠右后肢腓腸肌局部進(jìn)行推拿指揉法操作。為了規(guī)范指揉法操作時(shí)的刺激量，手法操作過程中右手拇指帶上美國(guó)Finger TPS公司生產(chǎn)的無線觸覺力指套進(jìn)行推拿手法操作，壓力5 N、頻率2 Hz。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法用Western blot檢測(cè)背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角組織NR2B蛋白的表達(dá)：療程結(jié)束后，所有組別大鼠麻醉后斷頭放血，立即于冰盤上用無菌器械迅速切取右側(cè)L4、L5背根神經(jīng)節(jié)及右側(cè)脊髓背角，分別置于1.5 ml離心管中，稱重。加入裂解液(按組織重量與RIRA組織裂解液體積比為1∶80 mg/μl)，超聲細(xì)胞破碎儀機(jī)勻漿，冰上裂解30 min，然后以14000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳后冰冷轉(zhuǎn)膜(280 mA∶90 min)，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別在NR2B(1∶500)和β-actin抗體(1∶2000)中孵化過夜，TBST液洗膜，加入HRP標(biāo)記二抗(1∶2000)室溫(37 ℃)孵育1 h，ECL發(fā)光法試劑盒顯色，使用Bio-Rad Automatic凝膠成像系統(tǒng)成像，Image Lab軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰色值分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。當(dāng)P≤0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)P≤0.01時(shí)，則表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而P>0.05則表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模成功CCI造模后第10天，CCI模型組和CCI+推拿組大鼠的PWT值、PWL值達(dá)最低水平，并保持在穩(wěn)定的水平，有明顯的機(jī)械痛覺過敏及熱痛覺過敏現(xiàn)象，為疼痛行為表現(xiàn)穩(wěn)定的動(dòng)物模型。

2.2 Western blot法檢測(cè)背根神經(jīng)節(jié)NMDAR2B表達(dá)的改變與空白組、假手術(shù)組相比，CCI模型組、CCI+推拿組的背根神經(jīng)節(jié)NMDAR2B的表達(dá)量均上調(diào)(P<0.01)；CCI模型組、CCI+推拿組的背根神經(jīng)節(jié)NMDAR2B的表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組大鼠右側(cè)L4、L5背根神經(jīng)節(jié)NMDAR2B表達(dá)量比較 (例，

2.3 Western blot法檢測(cè)脊髓背角NMDAR2B表達(dá)的改變與空白組、假手術(shù)組相比，CCI模型組的脊髓背角NMDAR2B的表達(dá)量上調(diào)(P<0.01)；與CCI模型組比較，CCI+推拿組的脊髓背角NMDAR2B的表達(dá)量被逆轉(zhuǎn)(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠右側(cè)脊髓背角NMDAR2B表達(dá)量比較 (例，

3 討論

NP是常見的疼痛，相當(dāng)部分頸肩腰腿痛屬于NP范疇，如頸、腰椎間盤突出癥或外周神經(jīng)干或神經(jīng)分支卡壓綜合征等引起的疼痛[9]。中醫(yī)將此類疾病歸為“經(jīng)筋病”范疇，推拿對(duì)“經(jīng)筋病”有很好的效果，如《黃帝內(nèi)經(jīng)太素·卷第十九》云：“痛生筋脈皮膚之間，為痹不仁，故以按摩醪醴?！?及《醫(yī)宗金鑒·正骨心法要旨》曰：“因跌撲閃失，以至骨縫開錯(cuò)，氣血郁滯，為腫為痛，宜用按摩法”等，但目前其機(jī)制尚不明確。

本研究參照Bennett G J的方法稍作改進(jìn)建立的大鼠CCI模型造模后引起的疼痛與臨床神經(jīng)損傷后神經(jīng)病理痛最為貼切。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCI模型建立后，大鼠有明顯的機(jī)械痛覺過敏及熱痛覺過敏等痛覺過敏現(xiàn)象。有研究顯示，CCI模型引起疼痛是由其受損部位傳入神經(jīng)異位放電產(chǎn)生異位敏感度提高所致，外周敏化由此產(chǎn)生；但Julius D用電刺激麻醉的受損部位后仍出現(xiàn)痛覺過敏，由此并不是單純外周敏化起作用，脊髓及脊髓以上神經(jīng)元對(duì)疼痛刺激的敏感性(即中樞敏化)亦起作用[10～12]。

背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia，DRG)作為痛覺傳入的第一級(jí)神經(jīng)元，在痛覺的外周敏化機(jī)制中起著重要的作用[13]。研究表明，外周敏化的持續(xù)興奮性沖動(dòng)經(jīng)DRG的Aδ和C纖維傳入脊髓背角，引起脊髓背角釋放谷氨酸增加，激活N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體，加強(qiáng)脊髓背角突觸后反應(yīng)、增多異位放電，引起中樞敏化[14～16]。

NMDA受體由NR1、NR2(A、B、C、D)、NR3(A、B)亞單位組成的聚合體。不同的亞基因其結(jié)構(gòu)及部位的不同介導(dǎo)不同的生理功能，目前有研究發(fā)現(xiàn)NR2B亞基與疼痛密切相關(guān)，認(rèn)為疼痛刺激經(jīng)外周感覺纖維傳入DRG，調(diào)控DRG合成NR2B蛋白，再分布于脊髓背角，使脊髓背角NMDA受體激活，引起中樞敏化[13，17]；本研究發(fā)現(xiàn)CCI模型DRG和脊髓背角NR2B表達(dá)量高于空白組、假手術(shù)組，與報(bào)道吻合；DRG和脊髓背角的含有NR2B亞基的NMDA受體在NP的產(chǎn)生和維持中起到重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷后大鼠脊髓背角NR2B表達(dá)明顯增加，本研究CCI模型脊髓背角NR2B表達(dá)量高于假手術(shù)組，與上述相關(guān)報(bào)道一致；虞雪融等[5]運(yùn)用NR2B拮抗劑能降低脊髓NR2B的表達(dá)，減輕疼痛；本研究發(fā)現(xiàn)推拿手法對(duì)DRG中NR2B蛋白表達(dá)沒有影響，但可抑制脊髓NR2B蛋白表達(dá)，由此推測(cè)推拿手法通過抑制脊髓NR2B蛋白表達(dá)，抑制脊髓背角中樞敏化，從而起到鎮(zhèn)痛的效應(yīng)。

綜上所述，背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角NMDA受體亞單位NR2B參與大鼠神經(jīng)病理痛的形成和維持，推拿手法可通過抑制脊髓NR2B蛋白表達(dá)，從而抑制脊髓背角中樞敏化以發(fā)揮鎮(zhèn)痛的作用。