肖 海，婁桂予，張 倩，郭謙楠，張照婧，吳 東，張夢汀，高 越，廖世秀△

(1.河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所，鄭州 450003；2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳與細(xì)胞生物學(xué)系 450003)

妊娠期間的胎兒和母體之間存在著復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)，母-胎界面調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)優(yōu)勢分化，有利于妊娠的順利進(jìn)行。皰疹病毒侵入介質(zhì)(herpes virus entry mediator,HVEM)基因上的一些單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)會(huì)對基因的表達(dá)或者功能造成影響，目前在很多腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)HVEM基因多態(tài)性會(huì)影響Treg的分化，進(jìn)而影響疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。目前尚無HVEM基因多態(tài)性與不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。本文通過對河南漢族人群的HVEM基因 rs1886730和rs2234167位點(diǎn)進(jìn)行研究，探討HVEM基因多態(tài)性與河南漢族人群URSA的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 病例組為2017年1-12月在河南省人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診的246例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)女性。入選標(biāo)準(zhǔn)：自然流產(chǎn)大于或等于3次，排除感染、血型不合、生殖道畸形、免疫因素、內(nèi)分泌異常、胚胎染色體異常等致病因素。對照組為2017年1-12月在河南誠信法醫(yī)司法鑒定所進(jìn)行親子鑒定生育過1名及以上正常健康孩子且無復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史的256例女性。本研究經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對象知情同意后分別抽取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血2 mL。

1.2方法

1.2.1rs1886730和rs2234167位點(diǎn)SNP檢測 采用廈門致善公司的Lab-Aid 820核酸提取Mini試劑提取樣本基因組DNA，PCR擴(kuò)增后利用Sanger法測序檢測樣本基因型。根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。PCR反應(yīng)體系：模版DNA 1.0 μL 2×PCR，Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，去離子水9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.2基因型判讀 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，切膠回收，利用Sanger測序法進(jìn)行測序。測序結(jié)果與NCBI中的野生型序列進(jìn)行Blast比對分析，判斷位點(diǎn)基因型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SHEsis軟件[2-3]在線分析數(shù)據(jù)，對HVEM基因rs1886730和rs2234167位點(diǎn)基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，采用χ2檢驗(yàn)比較2組間基因型頻率和等位基因頻率的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

通過Sanger測序發(fā)現(xiàn)246例病例組患者和256例對照組婦女HVEM基因的rs1886730位點(diǎn)有3種基因型，分別為CC、CT、TT，rs2234167位點(diǎn)有2種基因型，分別為GG和GA。河南漢族人群中HVEM基因rs2234167位點(diǎn)多態(tài)性與URSA無明顯相關(guān)性(P>0.05)；rs1886730位點(diǎn)T等位基因頻率在病例組和對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.007，P<0.01)，CT、TT基因型頻率在病例組和對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.236，P<0.01;t=14.420，P<0.01)。見表2、3。

表2 rs1886730基因型和等位基因在病例組和對照組的分布[n(%)]

表3 rs2234167基因型和等位基因在病例組和對照組的分布[n(%)]

-：無數(shù)據(jù)

3 討 論

自然流產(chǎn)是指妊娠在28周以前終止、胎兒體質(zhì)量在1 000 g以下者，發(fā)生率為15%～20%[4]。復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指連續(xù)發(fā)生3次及以上自然流產(chǎn)的，是妊娠常見的并發(fā)癥之一，發(fā)生率約為1%[5]。RSA病因極其復(fù)雜，目前已知致病因素有染色體異常、內(nèi)分泌失調(diào)、生殖器官畸形、感染、環(huán)境理化等。除上述病因以外，仍有大約50%的RSA患者的致病因素不明，臨床上稱之為URSA[6-7]。URSA會(huì)對廣大婦女的身體和心理造成巨大的傷害。由于URSA致病因素復(fù)雜多樣，且發(fā)病機(jī)制尚不明確，雖然目前有很多防治手段如：中西醫(yī)結(jié)合方法、免疫抑制劑、抗凝療法、主動(dòng)免疫療法及被動(dòng)免疫療法等，但療效均不明確。因此，探索URSA的發(fā)病機(jī)制對其防治具有十分重要的意義。

妊娠類似于同種異體移植過程，帶父系抗原的胚胎不被母體免疫系統(tǒng)排斥，是因?yàn)樘号c母體之間存在著復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)過程，通過這種相互作用建立的母-胎免疫耐受微環(huán)境保證了妊娠的順利進(jìn)行[8-9]。代孕的胎兒所攜帶的人類白細(xì)胞抗原系統(tǒng)與母體的完全不同，進(jìn)一步證實(shí)了母-胎免疫耐受微環(huán)境的存在[10]。研究表明自然流產(chǎn)模型組Treg顯著低于正常妊娠組，過繼轉(zhuǎn)輸Treg至流產(chǎn)模型小鼠可改善其妊娠預(yù)后，提示Treg不但參與了母-胎免疫耐受機(jī)制的形成而且對其維持有重要作用。樹突狀細(xì)胞( dendritic cells,DCs)是一種抗原遞呈細(xì)胞，DCs表面可表達(dá)B和T細(xì)胞衰減因子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)[11-12]。DCs可通過與廣泛表達(dá)在T細(xì)胞表面的HVEM特異性結(jié)合對T細(xì)胞起到調(diào)節(jié)作用，達(dá)到母-胎界面Treg優(yōu)勢分化的狀態(tài)，從而有助于維持母-胎界面免疫耐受狀態(tài)。BTLA/HVEM信號(hào)通路在腫瘤的T細(xì)胞抑制中發(fā)揮重要作用[13]。BTLA+DEC205+CD8+DCs可以通過BTLA/HVEM信號(hào)通路誘導(dǎo)Treg分化[14-15]。胚胎作為一種半同種移植物，能夠不被排斥，有賴于母胎間的免疫耐受，特別是母-胎界面免疫微環(huán)境的形成和維持，這種耐受一旦被破壞，則導(dǎo)致病理性妊娠?；蚨鄳B(tài)性可引起蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變，導(dǎo)致DCs無法通過BTLA/HVEM信號(hào)通路誘導(dǎo)Treg分化，即不同個(gè)體對URSA表現(xiàn)出不同的易感性。

有報(bào)道稱rs1886730位點(diǎn)的基因多態(tài)性與乳腺癌的易感性相關(guān)[1]。本研究結(jié)果顯示rs1886730位點(diǎn)CT、TT基因型在URSA組中的分布頻率顯著高于對照組，且T等位基因在URSA中的分布頻率高于對照組，提示此位點(diǎn)與河南漢族人群URSA的發(fā)病有關(guān)。rs1886730位于HVEM基因內(nèi)含子區(qū)域，內(nèi)含子區(qū)域在轉(zhuǎn)錄過程中起重要作用，內(nèi)含子區(qū)域發(fā)生基因突變，可能導(dǎo)致剪切位點(diǎn)的改變從而影響mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響蛋白的功能。CT、TT基因型為河南漢族人群URSA發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)基因型。T等位基因?yàn)楹幽蠞h族人群URSA發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)等位基因。

rs2234167位于HVEM基因的外顯子區(qū)域，該位點(diǎn)基因突變導(dǎo)致編碼的氨基酸由纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼?。有?bào)道rs2234167位點(diǎn)多態(tài)性會(huì)影響HVEM的功能和表達(dá)，進(jìn)而對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[1]。本研究結(jié)果顯示病例組中的GA基因型頻率和A等位基因的頻率均略高于對照組，但兩組數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，并且本研究在河南漢族人群中未檢測到AA基因型。推測該位點(diǎn)多態(tài)性存在種族差異，有必要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步確定該位點(diǎn)與URSA的關(guān)系。