孫 輝，馬凌波，董 飛，胡光榮△,何永捍，鄧 穎

(1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院急診科 150081;2.中國科學院昆明動物研究所,昆明 650223)

肝纖維化是慢性肝損傷所致的病理改變，表現(xiàn)為肝內(nèi)細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分過度沉積[1-2]，并影響肝臟的功能。肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)是肝內(nèi)ECM主要來源的HSCs，是肝纖維化形成的細胞學基礎(chǔ)[3-4]的增殖、分化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。肝硬化是各種慢性肝病所致肝功能受損從而影響體內(nèi)糖代謝的轉(zhuǎn)化[5]，導致乳酸在體內(nèi)的異常堆積，使細胞生存的微環(huán)境發(fā)生改變，刺激纖維結(jié)締組織的大量增生所致。但乳酸堆積對HSCs的影響尚未見文獻報道。本實驗采用體外培養(yǎng)的HSCs制作乳酸堆積模型，探討乳酸堆積對HSCs增殖、分化和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人HSCs(上海坤肯生物化工有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI AppliedBiosystems公司,美國)，L-乳酸、胎牛血清(Sigma公司,美國)，TRIzol，引物(Invitrogen公司,美國)，AnnexinV/PI雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，四甲基偶氮唑藍(MTT，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，CO2培養(yǎng)箱、光學顯微鏡、流式細胞儀、Real-time PCR儀(Thermo公司,美國)。

1.2方法

1.2.1HSCs的培養(yǎng) HSCs細胞接種于25 cm2無菌培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液5 mL，置于37 ℃、含5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，當細胞生長融合至80%～90%時進行實驗。

1.2.2細胞分組 把傳代好的HSCs分為4組，乳酸終濃度為0 mmol/L(對照)、0.5 mmol/L(HSCs+0.5 mmol/L乳酸組)、1.0 mmol/L(HSCs+1.0 mmol/L乳酸組)、2.0 mmol/L(HSCs+2.0 mmol/L乳酸組)，分別培養(yǎng)72 h，其中以含0 mmol/L乳酸的HSCs為對照組。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖 取生長狀態(tài)良好的HSCs，用0.25%胰酶消化，加入等量培養(yǎng)液中和胰酶并離心，棄上清液后加入PBS，再離心后加入不同乳酸濃度的培養(yǎng)液制成含細胞數(shù)為5×107/L的細胞懸液，接種于96孔板上，每孔200 μL，每組設(shè)6個復孔，同時設(shè)只加培養(yǎng)基而無細胞的空白對照孔。將各組細胞放置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后，加人20 μL MTT(5 g/L)后再培養(yǎng)4 h，離心棄上清液后加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15 min，使用全自動酶標儀檢測490 nm處的吸光度(A)值。HSCs增殖抑制率(%)=(1-各實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.2.4流式細胞儀測定HSCs凋亡和細胞周期 HSCs凋亡檢測:把生長良好的各組細胞經(jīng)消化、離心后分別調(diào)整為含細胞數(shù)為5×106/mL的細胞懸液，各組分別取1 mL于離心管中，經(jīng)反復離心洗滌混勻后，各組分別取250 μL，加入5 μL PI和10 μL AnnexinV-FITC，充分混合均勻后室溫下避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗每組重復3次。細胞周期檢測：各組細胞培養(yǎng)72 h后用0.25%胰酶消化收集細胞，PBS洗2遍，棄上清液，加入1 mL 70%預冷乙醇，吹打均勻，4 ℃過夜固定(12 h以上)。PBS洗滌去乙醇，1 000 r/min離心5 min，PBS洗2遍。0.5 mL PBS重懸細胞，加入PI和 RNase A至終濃度50 μg/mL，37 ℃ 溫浴30 min。用流式細胞儀測定細胞周期，實驗每組重復3次。

1.2.5real-time PCR法檢測α-SMA和Fasl mRNA

1.2.5.1提取總RNA 各組細胞培養(yǎng)72 h后,棄培養(yǎng)液,向24孔板中每孔加入0.2 mL TRIzol反復吹打后刮取裂解液分別移至滅菌的1.5 mL EP管中，室溫下靜置5 min。每組EP管中加0.2 mL氯仿，經(jīng)震蕩(15 s)-靜置(2 min)-離心(4 ℃，13 500×g、15 min)-上清液移管后，加入0.5 mL的異丙醇，再經(jīng)震蕩-靜置(10 min)-離心(4 ℃，13 500×g、10 min)-棄上清液后，加入1 mL 75%乙醇，最后輕洗沉淀-離心(4 ℃，10 600×g、5 min)-棄上清-室溫晾干后，加入DEPC水溶解并保存于冰上，待檢。

1.2.5.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 先測定總RNA濃度。按試劑盒操作說明書操作，將0.5 μg的樣本RNA、0.5 μL RTase、0.4 μL dNTP、1.0 μL 10×RT buffer、1.0 μL引物、7.5 μL雙蒸水配成10 μL反轉(zhuǎn)錄體系，上機。

1.2.5.3real-time PCR分析 首先在real-time PCR儀中進行40個循環(huán)(95 ℃15 s，60 ℃ 1 min)，緊接著在95 ℃條件下用SYBR Green PCR Master Mix進行變性10 min；利用ABI Prism?快速7500型熒光定量PCR儀對cDNA進行擴增。結(jié)果用實驗組目的基因相對于對照組基因變化的2-ΔΔCt表示。各基因real-time PCR引物序列見表1。

1.2.6caspase-3活性檢測 各組細胞培養(yǎng)經(jīng)胰蛋白酶消化、PBS洗滌后制備成細胞數(shù)為1×106/mL的單細胞懸液，取1 mL于離心管中經(jīng)離心(1 000 r/min、5 min)后棄上清液，加入50 μL預冷的細胞裂解液，冰浴10 min，再以1 000 r/min離心5 min，棄上清液后加入5 μL caspase-3底物(DEVD-FC)和50 μL 2×反應(yīng)緩沖液/二硫蘇糖醇(DTT)混合液，37 ℃恒溫水浴1 h，上機待檢。caspase-3相對活性=實驗組熒光強度/對照組熒光強度。

表1 real-time PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1乳酸對HSCs增殖的影響 不同濃度乳酸培養(yǎng)HSCs 72 h后用MTT法檢測HSCs的增殖能力發(fā)現(xiàn)，低濃度(≤2 mmol/L)乳酸對HSCs增殖具有明顯促進作用(P<0.05) ，之后隨著乳酸濃度的增加，乳酸對HSCs毒性增加，對HSCs生長有明顯的抑制作用(P<0.05)，見表2。

2.2乳酸對HSCs的凋亡和細胞周期的影響 不同濃度乳酸培養(yǎng)HSCs 72 h后采用流式細胞儀檢測HSCs凋亡和細胞周期發(fā)現(xiàn)，在乳酸濃度為0、0.5、1.0、2.0 mmol/L時HSCs的凋亡率與對照組比較，逐漸減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低濃度乳酸作用72 h可調(diào)節(jié)細胞周期，G0/G1期細胞減少，S期細胞增加，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

2.3乳酸對HSCs的凋亡基因FasL mRNA的表達和caspase-3活性的影響 各低濃度乳酸組與對照組比較，凋亡基因FasL mRNA的表達明顯減少(P<0.05)，caspase-3活性明顯降低(P<0.05)，并且其變化趨勢與乳酸濃度呈劑量效應(yīng)，見圖1A、B。

2.4乳酸對HSCs ECM中α-SMA mRNA的影響 real-time PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，低濃度乳酸可明顯刺激細胞外基質(zhì)α-SMA mRNA的表達(P<0.05)，見圖1C。

表2 乳酸對HSCs的抑制率

-：此項無數(shù)據(jù)；a：P<0.05，與對照組比較

表3 乳酸對HSCs凋亡和細胞周期的影響

a：P<0.05，與對照組比較

A:FasL;B：caspase-3;C:α-SMA;a：P<0.05，與對照組比較

圖1乳酸對HSCsFasL、caspase-3、α-SMAmRNA表達的影響

3 討 論

各種致病因子可導致肝內(nèi)基質(zhì)異常地沉積、結(jié)締組織異常增生，肝損傷在修復愈合的過程中伴有肝纖維化發(fā)生，長期的纖維化過程則會發(fā)展成肝硬化。目前對肝纖維化的研究主要集中在HSCs的激活、肝內(nèi)基質(zhì)合成和降解失衡、有關(guān)的細胞因子(如TNF-α、PDGF、TGF-β等)、天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)[6-7]等方面。而HSCs的激活則是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)[8-9]，損傷的肝細胞釋放細胞因子如PDGF、TGF-β等，導致HSCs被激活，活化的HSCs分泌合成ECM增多，并轉(zhuǎn)化為成纖維細胞。α-SMA是ECM的成分之一，是HSCs活化的標志物[10]，若肝臟中出現(xiàn)α-SMA陽性細胞表示HSCs開始向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，促進肝纖維化的發(fā)生。

目前的研究認為激活的HSCs有兩個去向:發(fā)生細胞凋亡[11]和由激活態(tài)轉(zhuǎn)變回靜止態(tài)[12]?；罨腍SCs通過發(fā)生細胞凋亡而消除,是纖維化逆轉(zhuǎn)的主要機制。HSCs凋亡主要通過死亡受體信號傳導通路，當死亡因子Fas及其配體FasL結(jié)合時，啟動凋亡通路，引起下游的caspase-3等表達，導致細胞凋亡。

本研究通過體外培養(yǎng)人HSCs，加入不同濃度的乳酸培養(yǎng)基來模擬慢性肝病時體內(nèi)乳酸堆積的情況，觀察乳酸堆積對HSCs的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度(≤2 mmol/L)乳酸能激活HSCs，促進其增殖，但是當乳酸濃度持續(xù)增高后，乳酸對HSCs的毒性增強，引起細胞凋亡。在低濃度乳酸刺激下，HSCs由G0/G1期進入S期的過程增加，導致G0/G1期細胞減少，處于S期的細胞則相應(yīng)增加，同時細胞的凋亡率明顯減少。目前認為細胞周期有2個突發(fā)性的轉(zhuǎn)折點：G1至S期及G2至M期[13]。因此認為，低濃度乳酸對HSCs的細胞周期具有重要的調(diào)控作用，使S期的細胞明顯增加而處于增殖狀態(tài)，提示低濃度乳酸對肝纖維化的作用可能是通過影響HSCs的增殖周期實現(xiàn)的。在低濃度乳酸刺激下，HSCs分泌α-SMA增加，促進HSCs向成纖維細胞分化，進一步加重肝纖維化。在低濃度乳酸刺激下，F(xiàn)asL mRNA的表達減少和caspase-3活性降低，故推測低濃度乳酸對HSCs凋亡的影響可能是通過抑制死亡受體通路的激活和降低凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的活性。

總之，本研究從分子水平證實了低濃度乳酸可促進HSCs增殖，使細胞從靜止期(G0)進入分裂間期；促進ECM合成，減少細胞凋亡的死亡受體通路激活，抑制HSCs凋亡，使HSCs向成纖維細胞分化，增加肝纖維化風險。